GSK3326595 is a promising drug to prevent SARS-CoV-2 Omicron and other variants infection by inhibiting ACE2-R671 di-methylation.
包含体外生化实验、细胞共免疫沉淀、质谱分析、突变体验证、假病毒感染实验等多个独立证据层级，且包含功能验证和机制验证。
HEK-293T 细胞 A549 细胞 BEAS-2B 细胞 HK2 细胞
PRMT5 介导 ACE2-R671 对称二甲基化 ACE2-R671K 突变对 ACE2-RBD 结合的影响 GSK3326595 处理浓度（如 25 nM）及对细胞增殖的影响 SARS-CoV-2 变异株 Spike1（Omicron、Delta、Beta）与 ACE2 的结合 SARS-CoV-2 假病毒感染实验
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
检测 PRMT5 是否甲基化 ACE2，以及该甲基化是否影响 ACE2 与 RBD 结合。
在 HEK-293T 和 A549 细胞中共表达 Flag-ACE2 和 GFP-RBD，用 PRMT5 抑制剂 GSK3326595 或 PRMT1 抑制剂 AMI-1 处理，通过 Co-IP 和 Western blot 检测 ACE2-RBD 相互作用和 ACE2 甲基化水平。
确定 PRMT5 介导的 ACE2 甲基化具体位点。
过表达 Flag-ACE2 并进行免疫沉淀，通过质谱分析鉴定甲基化位点；构建 ACE2-R671K 和 R644K 突变体，检测甲基化水平和 PRMT5 相互作用。
验证 R671 甲基化是否直接影响 ACE2-RBD 结合。
在 HEK-293T 和 A549 细胞中共表达 GFP-RBD 和 Flag-ACE2-WT 或 R671K 突变体，通过 Co-IP 检测结合变化；体外 GST pull-down 实验验证甲基化 GST-ACE2 与 RBD 的结合。
验证 R671 甲基化是否通过促进 N322 糖基化增强 ACE2-RBD 结合。
构建 ACE2-N322Q 单突变和 R671K+N322Q 双突变，检测 ACE2-RBD 结合；用 GSK3326595 处理，检测 N322Q 突变体中 ACE2-RBD 结合变化。
测试 GSK3326595 是否能抑制 ACE2 与不同变异株 Spike1 的结合。
将 Flag-ACE2-WT 或 R671K 细胞裂解液与 His-S1-Omicron、Delta、Beta 蛋白孵育，进行 Co-IP 检测；用不同浓度 GSK3326595 处理细胞，检测结合变化。
评估 GSK3326595 对 SARS-CoV-2 假病毒进入宿主细胞能力的影响。
在 ACE2 过表达的 HEK-293T 或 A549 细胞中，用不同浓度 GSK3326595 处理，或敲低 PRMT5，或过表达 ACE2-WT/R671K 和 PRMT5，检测假病毒感染率。
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 细胞培养 | DMEM 培养基 | -- | -- |
| RPMI-1640 培养基 | -- | -- | |
| 胎牛血清 | -- | -- | |
| 细胞转染 | 聚乙烯亚胺 | PROTEINTECH | -- |
| Lipofectamine 2000 | Thermo Fisher Scientific | -- | |
| 质粒构建 | Quick Mutation™ Plus 试剂盒 | Beyotime | D0208S |
| 蛋白表达与纯化 | 谷胱甘肽琼脂糖珠 | MCE | HY-K0211 |
| 假病毒感染实验 | 荧光素酶检测系统 | Promega | E1500 |
| Western blot/免疫沉淀 | GAPDH 抗体 | Proteintech | 60004-1-AP |
| PRMT5 抗体 | Proteintech | 18436-1-AP | |
| GFP-Tag 抗体 | SUNGENE BIOTECH | KM8009 | |
| Flag-Tag 抗体 | SUNGENE BIOTECH | KM8002 | |
| ACE2 抗体 | CST | 92485S | |
| His-Tag 抗体 | Absin | abs830002ss | |
| Myc-Tag 抗体 | Servicebio | GB12076 | |
| GST-Tag 抗体 | SUNGENE BIOTECH | KM8005 | |
| 免疫沉淀 | 抗 GFP 纳米磁珠 | AlpaLife | KTSM1301 |
| 抗 Myc 纳米磁珠 | AlpaLife | KTSM1306 | |
| 抗 Flag 磁珠 | Beyotime | P2271-2ml | |
| 质粒构建 | Flag-ACE2-WT 质粒 | Sino Biological | HG10108-NF |
| GFP-RBD 质粒 | Sino Biological | VG40592-ACGLN | |
| 蛋白结合实验 | SARS-CoV-2 Spike S1-Omicron His 标签蛋白 | Sino Biological | 40591-V08H41 |
| SARS-CoV-2 Spike S1-Delta His 标签蛋白 | Sino Biological | 40591-V08H23 | |
| SARS-CoV-2 Spike S1-Beta His 标签蛋白 | Sino Biological | 40591-V08H10 | |
| 假病毒感染实验 | SARS-CoV-2 刺突假病毒 | Sino Biological | PSV001 |
| 质粒构建 | pGEX-4T-1 载体 | GE Healthcare | -- |
| 药物处理 | GSK3326595 | -- | -- |
| AMI-1 | -- | -- | |
| 甲基化实验 | S-腺苷甲硫氨酸 | -- | -- |
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 细胞培养 | 细胞系（HEK-293T、A549、BEAS-2B、HK2）和培养基（DMEM/RPMI-1640）及 FBS 浓度 阅读提示：Methods 2.1 Cells culture and transfection |
| 药物处理 | GSK3326595 和 AMI-1 的浓度及处理时间（如 100 nM 处理 48 小时） 阅读提示：Figure 1 图注和 Methods 2.1 |
| 质粒构建 | Flag-ACE2-WT、GFP-RBD、突变体质粒（R671K、N322Q 等）的来源和构建方法 阅读提示：Methods 2.2 Plasmids and SARS-CoV-2 Spike1 proteins |
| 蛋白结合实验 | His-S1-Omicron、His-S1-Delta、His-S1-Beta 蛋白的浓度及孵育条件 阅读提示：Results 3.4 和 Figure 4 图注 |
| 假病毒感染实验 | 细胞接种密度（5×10^4）、假病毒体积（5 μl）、处理时间（12 小时预处理、6 小时感染、48 小时培养）、GSK3326595 浓度（25 nM 等） 阅读提示：Methods 2.3 SARS-CoV-2 spike pseudovirus infection assays |
