TOX4染色质占据模式分析
确定TOX4在基因组上的结合位置及其与Pol II、基因表达的关系。
在K562细胞中进行TOX4的ChIP-seq和CUT&Tag实验，分析其占据位点分布，并与Pol II CUT&Tag和RNA-seq数据进行比较。
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TOX4在人细胞中促进RNA聚合酶II的启动子近端暂停和C端结构域去磷酸化
TOX4 facilitates promoter-proximal pausing and C-terminal domain dephosphorylation of RNA polymerase II in human cells.
实验完整度
高包含细胞系功能缺失实验、多种基因组学分析、体外蛋白结合和磷酸酶活性验证，证据层级较为全面。
主要模型
K562细胞 293T细胞 High Five昆虫细胞 体外重建体系
重点核对
TOX4敲除K562细胞系 TOX4急性降解K562-AID-TOX4细胞系 DRB处理和4sU标记时间点（0、10、20分钟） Pol II、SPT5、PP1α/β/γ的CUT&Tag和Western blot检测
摘要
TOX4是功能尚不明确的PP1磷酸酶调节因子之一。在这里，我们显示TOX4的染色质占据模式类似于RNA聚合酶II（Pol II），其缺失增加了CTD磷酸化Pol II的细胞水平，但主要降低了Pol II在启动子上的占据。此外，通过4sUDRB-seq进行的延伸速率分析表明，TOX4限制暂停释放和早期延伸，但促进晚期延伸。而且，TT-seq分析表明，TOX4缺失主要降低转录输出。在机制上，TOX4可能通过促进CTD丝氨酸2和DSIF去磷酸化来限制暂停释放，并通过促进CTD丝氨酸2和5去磷酸化来促进Pol II回收和重新起始。进一步，在PP1磷酸酶中，TOX4优先结合PP1α，并能够在体外促进Pol II CTD去磷酸化。这些结果为更好地理解TOX4在转录调控中的作用奠定了基础。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- TOX4作为PP1磷酸酶的调节因子，在转录调控中发挥什么作用？
- 核心机制
- TOX4通过促进Pol II CTD Ser-2和SPT5 Thr-806的去磷酸化来限制暂停释放和早期延伸，并通过促进CTD Ser-2和Ser-5的去磷酸化来促进Pol II回收和转录重新起始。
- 主要证据
- TOX4敲除导致Pol II CTD磷酸化水平升高、启动子占据降低、4sUDRB-seq显示早期延伸速率增加而晚期降低、TT-seq显示转录输出降低，且体外实验显示TOX4-PP1α促进CTD去磷酸化。
- 研究意义
- 该研究揭示了TOX4在转录调控中的新功能，为理解PP1磷酸酶复合物如何通过去磷酸化调控Pol II循环提供了基础。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
TOX4敲除细胞系构建及转录组分析
评估TOX4缺失对基因表达的影响。
通过CRISPR-Cas9生成TOX4敲除K562细胞，进行RNA-seq分析差异表达基因，并进行KEGG通路富集分析。
Pol II CTD磷酸化水平和占据分析
检测TOX4缺失对Pol II CTD磷酸化和染色质占据的影响。
通过Western blot检测细胞中total、Ser-5和Ser-2磷酸化Pol II水平，通过CUT&Tag分析其在基因组上的占据。
转录延伸速率分析
确定TOX4对暂停释放和延伸速率的影响。
通过4sUDRB-seq在DRB去除后0、10、20分钟分析Pol II延伸边界，计算延伸速率。
SPT5磷酸化和NELF占据分析
探究TOX4是否通过影响DSIF和NELF来限制暂停释放。
通过Western blot检测SPT5和p-SPT5 Thr-806水平，通过CUT&Tag分析SPT5、p-SPT5 Thr-806和NELF-E的染色质占据。
染色质可及性分析
评估TOX4缺失是否通过改变染色质可及性影响延伸。
通过ATAC-seq分析TOX4 KO和对照细胞的染色质可及性变化，并与TOX4占据和延伸速率变化关联。
PP1磷酸酶结合和活性分析
确定TOX4与PP1磷酸酶的相互作用及其对CTD去磷酸化的影响。
通过CUT&Tag分析PP1α/β/γ占据，通过体外结合实验检测TOX4与各PP1的结合，通过体外磷酸酶实验检测TOX4-PP1α对Pol II CTD的去磷酸化活性，并通过co-IP定位TOX4结合区域。
转录输出和Pol II回收分析
评估TOX4对转录输出和Pol II回收的影响。
通过TT-seq测量转录输出，通过Western blot分析游离和染色质结合的Pol II水平，通过CUT&Tag分析TBP占据，并将Pol II TR和转录输出变化分组分析。
基因外转录本分析
检测TOX4是否调控eRNA、lncRNA和PROMPT等基因外转录。
分析TT-seq数据，识别差异表达的基因外转录本，并注释其类型。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 细胞培养 | DMEM培养基 | -- | -- |
| 胎牛血清 | -- | -- | |
| 青霉素/链霉素 | -- | -- | |
| L-谷氨酰胺 | -- | -- | |
| SIM SF培养基 | Sino Biological | MSF1 | |
| Western blot | Pol II抗体 | Santa Cruz | sc-899 |
| Pol II Ser-2p抗体 | Active Motif | 61083 | |
| Pol II Ser-5p抗体 | Active Motif | 61085 | |
| TOX4抗体 | Bethyl | A304-873A | |
| PP1α抗体 | Bethyl | A300-904A | |
| PP1β抗体 | Bethyl | A300-905A | |
| PP1γ抗体 | Bethyl | A300-906A | |
| PNUTS抗体 | Bethyl | A300-439A | |
| WDR82抗体 | CST | 99715 | |
| SPT5抗体 | Bethyl | A300-868A | |
| p-SPT5 Thr-806抗体 | Fisher Lab | -- | |
| CRISPR-Cas9 | lentiGuide-Puro载体 | Addgene | Plasmid #52963 |
| pBabe TIR1-9myc载体 | Addgene | Plasmid #64945 | |
| pSpCas9(BB)-2A-GFP (PX458)载体 | Addgene | Plasmid #48138 | |
| RNA提取 | RNeasy Plus Mini试剂盒 | Qiagen | 74134 |
| Quick-RNA MiniPrep试剂盒 | Zymo Research | R1054 | |
| ChIP | EGS交联剂 | Thermo | 21565 |
| 蛋白酶抑制剂混合物 | Millipore | 535140 | |
| Dynabeads蛋白A磁珠 | Thermo | 10002D | |
| ChIP DNA清洁与浓缩试剂盒 | Zymo Research | D5205 | |
| 4sUDRB-seq | DRB | Sigma | D1916 |
| 4-硫尿苷 | Sigma | T4509 | |
| Dynabeads磁珠 | Thermo | 11205D | |
| TT-seq | TRNzol试剂 | -- | -- |
| 4-硫尿嘧啶 | -- | -- | |
| Dynabeads M-280链霉亲和素磁珠 | Thermo | -- | |
| Co-IP | 二甲基亚胺酸酯 | Pierce | 20660 |
| 蛋白纯化 | 抗Flag M2磁珠 | Sigma | M8823 |
| HisPur Ni-NTA磁珠 | Thermo | 88831 | |
| 293无血清培养基 | Union-Biotech | UP1000 | |
| 肝素 | Sigma | h3149 | |
| 苯zonase核酸酶 | Sigma | E1014-5KU | |
| Millipore超滤浓缩管 | Millipore | -- | |
| 数据分析 | ChemiDoc Touch成像系统 | Bio-Rad | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| TOX4染色质占据分析 | TOX4 ChIP-seq和CUT&Tag的生物学重复、高置信峰的定义标准 阅读提示：Methods: CUT&Tag and data analyses; Results: 图1a、b |
| TOX4敲除实验 | K562-iCas9细胞系构建、gRNA序列、TOX4敲除验证 阅读提示：Methods: Generation of knockout and knockin cell lines by CRISPR-Cas9; Results: 图1d |
| RNA-seq | RNA提取试剂盒、差异表达阈值 阅读提示：Methods: RNA extraction, reverse transcription, RNA-seq, and data analyses; Results: 图1g-i |
| Pol II CUT&Tag | 抗体、细胞数量、数据标准化方法 阅读提示：Methods: CUT&Tag and data analyses; Results: 图2b-h |
| 4sUDRB-seq | DRB浓度、4sU标记时间、基因长度筛选、延伸速率计算方法 阅读提示：Methods: 4sUDRB-seq and data analyses; Results: 图4 |
| TT-seq | 细胞数量、4sU处理时间、酵母spike-in、差异表达阈值 阅读提示：Methods: TT-seq and data analyses; Results: 图7a-d |
| ATAC-seq | 细胞数量、Tn5转座酶、差异可及性阈值 阅读提示：Methods: ATAC-seq and data analyses; Results: 补充图4 |
| 体外结合和磷酸酶实验 | 蛋白表达系统、纯化方法、反应条件 阅读提示：Methods: Protein expression and purification, In vitro phosphatase assay; Results: 图6 |
| Western blot | 抗体稀释比例、内参选择、图像分析软件 阅读提示：Methods: Quantitative immunoblotting; Results: 图2a、图5a、图6e-g、j |