Omicron刺突蛋白表达与纯化
获取足量且纯度高的Omicron刺突蛋白用于结构及功能研究
利用HEK293F细胞表达Omicron刺突蛋白（S-2P-GSAS或S-6P-RRAR），经金属亲和、Strep亲和和凝胶过滤层析纯化。
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Omicron SARS-CoV-2 突变稳定刺突蛋白 up-RBD 构象并导致非 RBM 结合单克隆抗体逃逸
Omicron SARS-CoV-2 mutations stabilize spike up-RBD conformation and lead to a non-RBM-binding monoclonal antibody escape.
实验完整度
高包含多种冷冻电镜结构解析（apo、ACE2结合、S309结合、S304复合物）、SPR亲和力测定、假病毒中和实验及反向突变验证，构成多层级功能与机制验证。
主要模型
Omicron刺突蛋白三聚体（apo及复合物） 人ACE2结合模型 假病毒中和实验（Vero细胞） Omicron-L371S/P373S/F375S突变刺突蛋白
重点核对
刺突蛋白与hACE2的摩尔比（1:4）及孵育条件（4°C过夜） 冷冻电镜样品浓度与网格类型（如apo spike 1.0 mg/mL，C-flat R1.2/1.3） S304中和实验的抗体稀释方案与感染时间（15小时） 关键突变位点S371L、S373P、S375F对构象稳定性的影响 SPR实验的蛋白浓度范围及拟合模型（1:1 Langmuir模型）
摘要
Omicron 新冠病毒正在全球迅速传播。为了阐明新出现的突变对刺突蛋白特性的影响，我们通过冷冻电镜对 apo Omicron 刺突蛋白及其与人 ACE2 或 S309 中和抗体的复合物进行了系统的结构分析。Omicron 刺突蛋白在结合 ACE2 前后均优先采用单 RBD-up 构象，这与原型株和其他四种关切变异株在结合 ACE2 时产生的协调构象变化（形成更多 up-RBD）形成鲜明对比。此外，我们发现 S371L、S373P 和 S375F 替换增强了单 RBD-up 构象的稳定性，从而阻止了由 ACE2 结合触发的更多 up-RBD 暴露。单 RBD-up 构象稳定性的增加限制了靶向封闭构象中隐蔽表位的 S304 中和抗体的可及性，从而促进了 Omicron 的免疫逃逸。这些结果扩展了我们对 Omicron 刺突蛋白构象、受体结合和抗体逃逸机制的理解。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- Omicron刺突蛋白的突变如何影响其构象动态、受体结合及抗体逃逸能力？
- 核心机制
- Omicron刺突蛋白通过S371L、S373P和S375F替换增强单RBD-up构象的稳定性，限制RBD的构象变化，从而减少S304等依赖开放构象的抗体的可及性，实现免疫逃逸。
- 主要证据
- 冷冻电镜解析的apo、ACE2结合及S309结合的Omicron刺突蛋白结构显示其优先采用单RBD-up构象；反向突变（L371S等）导致ACE2结合后主要呈三RBD-up构象；SPR显示S304与Omicron RBD结合亲和力增强，但假病毒中和实验显示其IC50显著升高。
- 研究意义
- 该研究揭示了Omicron刺突蛋白通过稳定单RBD-up构象逃逸构象依赖性抗体的新机制，为开发靶向保守表位且构象非依赖的全沙贝科病毒中和抗体提供了方向。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
冷冻电镜样品制备与数据采集
解析Omicron刺突蛋白及其复合物的高分辨率结构
制备apo刺突蛋白、刺突-hACE2复合物、刺突-S309复合物及突变体复合物的冷冻样品，在Titan Krios电镜上采集数据。
结构和构象分析
确定Omicron刺突蛋白的构象偏好及突变的影响
通过3D分类和局部细化，分析apo和复合物中RBD的构象分布，比较不同状态的结构差异。
SPR亲和力测定
评估S304抗体对Omicron和原型RBD的结合亲和力
用BIAcore 8K进行单循环动力学分析，捕获S304抗体，流过不同浓度的RBD。
假病毒中和实验
评估S304抗体对Omicron和原型假病毒的中和活性
将S304抗体四倍系列稀释，与假病毒混合，感染Vero细胞，15小时后计数荧光细胞。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 蛋白表达 | SMM 293-TII培养基 | Sino Biological | M293TII |
| M293-SUPI补充物 | Sino Biological | M293-SUPI | |
| 蛋白纯化 | HisTrap HP 5 mL 预装柱 | GE Healthcare | -- |
| StrepTrap HP 5 mL 预装柱 | GE Healthcare | -- | |
| HiLoad Superose 6 increase 10/300 GL 凝胶过滤柱 | GE Healthcare | -- | |
| Superdex 200 10/300 GL 凝胶过滤柱 | GE Healthcare | -- | |
| Protein A 5 mL 亲和柱 | GE Healthcare | -- | |
| 冷冻电镜 | Titan Krios 透射电子显微镜 | Thermo Fisher Scientific | -- |
| K3 直接电子探测器 | Thermo Fisher Scientific | -- | |
| Vitrobot Mark IV 冷冻制样仪 | Thermo Fisher Scientific | -- | |
| C-flat R1.2/1.3 300目 微栅 | -- | -- | |
| Quantifoil R1.2/1.3（金300目）微栅 | -- | -- | |
| 氧化石墨烯 | -- | -- | |
| Pelco easiGlow 辉光放电仪 | Pelco | -- | |
| HARRICK PLASMA PDC-32G-2 辉光放电仪 | HARRICK PLASMA | -- | |
| SPR | BIAcore 8K 分子互作仪 | GE Healthcare | -- |
| Protein A 芯片 | GE Healthcare | -- | |
| Biacore Insight 评估软件 v.3.0 | GE Healthcare | -- | |
| 假病毒中和 | CQ1 共聚焦图像细胞仪 | Yokogawa | -- |
| 抗VSV-G抗体 | I1-Hybridoma | -- | |
| 假病毒包装 | 0.45 μm滤膜 | Millipore | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 蛋白表达与纯化 | HEK293F细胞培养条件、质粒转染量（1g质粒+3mg PEI）、纯化柱类型（HisTrap、StrepTrap、凝胶过滤） 阅读提示：Methods中的“Protein expression and purification” |
| 冷冻电镜样品制备 | 蛋白浓度（apo 1.0 mg/mL，复合物3.0 mg/mL）、网格类型（C-flat或Quantifoil）、冷冻制样仪设置（blot time等） 阅读提示：Methods中的“Cyro-EM sample preparation and data acquisition” |
| 构象分析 | 数据处理软件版本（cryoSPARC v3.3.1, RELION-3.1）、分类策略及粒子数、分辨率标准 阅读提示：Methods中的“Image processing and 3D reconstruction” |
| SPR结合实验 | S304抗体捕获方式、RBD浓度范围（原型50-3.125 nM，Omicron 25-1.5625 nM）、拟合模型（1:1 Langmuir） 阅读提示：Methods中的“Measurement of S304 binding to Omicron and prototypic spike using SPR” |
| 假病毒中和实验 | S304抗体初始浓度（100 μg/mL）及稀释倍数（四倍）、感染Vero细胞时间（15h）、GFP阳性细胞计数仪器（CQ1） 阅读提示：Methods中的“Neutralization assay based on the pseudovirus infection” |