体外筛选与化合物鉴定
筛选能够抑制醛缩酶活性、模拟葡萄糖饥饿的小分子化合物
采用醛缩酶/TPI/GPDH偶联酶学实验筛选约5000个化合物，鉴定1,3-二取代咪唑衍生物，通过构效关系优化得到aldometanib，并通过SPR、质谱和分子对接验证其结合机制。
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醛缩酶抑制剂aldometanib模拟葡萄糖饥饿激活溶酶体AMPK
The aldolase inhibitor aldometanib mimics glucose starvation to activate lysosomal AMPK
实验完整度
高包含体外酶学筛选、细胞实验、动物模型（小鼠、大鼠、线虫）等多层级验证，并进行了功能验证（降糖、缓解脂肪肝）和机制验证（依赖溶酶体通路）。
主要模型
HEK293T细胞 小鼠胚胎成纤维细胞(MEFs) 小鼠原代肝细胞和骨骼肌细胞 C57BL/6小鼠和ZDF大鼠 秀丽隐杆线虫(C. elegans)
重点核对
aldometanib对ALDOA的IC50约为50 μM，SPR结合的KD约为20 μM aldometanib在5 nM浓度即可激活细胞AMPK，且依赖于溶酶体通路 口服灌胃2 mg/kg aldometanib可激活小鼠和大鼠多种组织AMPK aldometanib在肥胖小鼠中降糖依赖于肌肉AMPK aldometanib延长线虫和小鼠寿命依赖于AMPK通路
摘要
5'-单磷酸腺苷激活蛋白激酶（AMPK）的活性与细胞葡萄糖可用性呈负相关。当葡萄糖水平较低时，糖酵解酶醛缩酶不与果糖-1,6-二磷酸（FBP）结合，而是发出信号激活溶酶体AMPK。在这里，我们表明用小分子aldometanib阻断FBP与醛缩酶的结合，可选择性地激活AMPK的溶酶体库，并在啮齿动物中产生有益代谢效应。我们在醛缩酶抑制剂筛选中鉴定了aldometanib，并表明它阻止FBP与v-ATP酶相关醛缩酶结合，并激活溶酶体AMPK，从而模拟细胞葡萄糖饥饿状态。在雄性小鼠中，aldometanib引发不依赖胰岛素的降糖作用，而不引起低血糖。Aldometanib还减轻了肥胖雄性啮齿动物的脂肪肝和非酒精性脂肪性肝炎。此外，aldometanib延长了秀丽隐杆线虫和小鼠的寿命和健康寿命。总之，aldometanib模拟并采用与葡萄糖饥饿相关的溶酶体AMPK激活途径来发挥生理作用，并可能具有作为人类代谢性疾病治疗药物的潜力。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- aldometanib是否通过抑制FBP与醛缩酶结合来模拟葡萄糖饥饿，选择性激活溶酶体AMPK，从而发挥降糖、缓解脂肪肝和延缓衰老的作用？
- 核心机制
- aldometanib结合醛缩酶Lys230残基，阻断FBP结合，抑制TRPV和v-ATPase，促进AXIN/LKB1溶酶体易位，从而激活溶酶体AMPK，而不影响细胞能量状态。
- 主要证据
- 体外酶活和SPR证实aldometanib抑制醛缩酶；细胞实验显示其激活AMPK依赖于LKB1、TRPV、AXIN、LAMTOR1等溶酶体通路组分；动物实验显示其降糖、缓解脂肪肝和NASH、延长寿命，且这些效应在AMPK或LAMTOR1敲除后消失。
- 研究意义
- aldometanib为代谢性疾病（如糖尿病、脂肪肝）提供潜在治疗策略，并可能用于促进健康衰老。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
细胞水平AMPK激活验证
验证aldometanib在细胞内是否通过溶酶体通路激活AMPK
在HEK293T、MEFs、原代肝细胞和肌细胞中检测AMPK及其底物ACC的磷酸化水平；利用基因敲除细胞（LKB1-/-、TRPV-QKO、AXIN-/-等）验证通路依赖性；通过亚细胞分级分离检测溶酶体AMPK的激活。
体内药效评估
评估aldometanib在啮齿动物中的降糖、缓解脂肪肝和NASH的作用
对正常小鼠、HFD诱导肥胖小鼠和ZDF大鼠口服灌胃aldometanib，检测血糖、胰岛素、葡萄糖耐量、肝脏甘油三酯、肝纤维化标志物等；利用组织特异性AMPK或LAMTOR1敲除小鼠验证机制。
寿命与健康寿命评估
评估aldometanib对线虫和小鼠寿命及健康寿命的影响
在NGM培养基中添加aldometanib培养线虫，记录寿命、咽泵速率、氧化应激抗性、繁殖力；在1岁龄小鼠饮水中添加aldometanib，记录寿命、运动能力、握力、肌肉线粒体功能等。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 化合物合成 | 2-甲基咪唑 | -- | M50850 |
| 试剂配制 | Kolliphor HS 15 | Sigma | 42966 |
| 细胞培养 | DMEM培养基 | Thermo Scientific | 12800082 |
| 胎牛血清 | Thermo Scientific | 10099141C | |
| 青霉素-链霉素 | Thermo Scientific | 15140163 | |
| 聚乙烯亚胺 | Polysciences | 23966 | |
| Lipofectamine 2000 | Thermo Scientific | 11668500 | |
| 聚凝胺 | Sigma | H9268 | |
| 胶原酶B | Sigma | 11088831001 | |
| 分散酶II | Sigma | 4942078001 | |
| 碱性成纤维细胞生长因子 | Thermo Scientific | 13256-029 | |
| Ham's F-10培养基 | Thermo Scientific | 11550043 | |
| William's E培养基 | Thermo Scientific | 12551032 | |
| 肝脏灌注培养基 | Thermo Scientific | 17701 | |
| 肝脏消化培养基 | Thermo Scientific | 17703 | |
| 细胞处理 | 二甲基亚砜 | Sigma | D2650 |
| 阿卡地新 | Sigma | A9978 | |
| 氯化铵 | Sigma | A4514 | |
| FITC-葡聚糖 | Sigma | 90718 | |
| 泰洛沙泊 | Sigma | T0307 | |
| 橄榄油 | -- | -- | |
| 他莫昔芬 | -- | -- | |
| 2-脱氧-D-葡萄糖 | Sigma | D8375 | |
| Western blot | 抗磷酸化AMPKα-T172抗体 | Cell Signaling Technology | 2535 |
| 抗AMPKα抗体 | Cell Signaling Technology | 2532 | |
| 抗磷酸化ACC-Ser79抗体 | Cell Signaling Technology | 3661 | |
| 抗ACC抗体 | Cell Signaling Technology | 3662 | |
| HRP标记的山羊抗小鼠IgG | Jackson ImmunoResearch | 115-035-003 | |
| HRP标记的山羊抗兔IgG | Jackson ImmunoResearch | 111-035-003 | |
| PVDF膜 | Merck | IPVH00010 | |
| 免疫沉淀 | 抗AXIN抗体 | Santa Cruz Biotechnology | sc-8567 |
| 蛋白A琼脂糖 | Cytiva | 17127904 | |
| 蛋白G琼脂糖 | Cytiva | 17061806 | |
| 检测试剂盒 | LabAssay甘油三酯试剂 | Wako | 290-63701 |
| 小鼠超灵敏胰岛素ELISA试剂盒 | ALPCO | 80-INSMSU-E10 | |
| 大鼠超灵敏胰岛素ELISA试剂盒 | ALPCO | 80-INSRTU-E01 | |
| ALT检测试剂盒 | Nanjing Jiancheng Bioengineering Institute | C009-2-1 | |
| AST检测试剂盒 | Nanjing Jiancheng Bioengineering Institute | C010-2-1 | |
| ALP检测试剂盒 | Nanjing Jiancheng Bioengineering Institute | A059-2-2 | |
| 羟脯氨酸检测试剂盒 | Abcam | ab222941 | |
| 糖原检测试剂盒 | Sigma | MAK016 | |
| PAS染色系统试剂盒 | Sigma | 395B | |
| Apo-BrdU原位DNA片段化检测试剂盒 | BioVision | K401 | |
| 天狼星红染色试剂盒 | Abcam | ab150681 | |
| Biospin组织基因组DNA提取试剂盒 | BioFlux | BSC04M1 | |
| 溶酶体分离试剂盒 | Sigma | LYSISO1 | |
| 内质网分离试剂盒 | Sigma | ER0100 | |
| RNA分析 | TRIzol试剂 | Thermo Scientific | 15596018 |
| ReverTra Ace qPCR RT预混液 | Toyobo | FSQ-301 | |
| Maxima SYBR Green/ROX qPCR预混液 | Thermo Scientific | K0223 | |
| 代谢物检测 | [U-13C]-葡萄糖 | Cambridge Isotope Laboratories | CLM-1396 |
| [U-13C]-谷氨酰胺 | Cambridge Isotope Laboratories | 184161-19-1 | |
| [U-13C]-棕榈酸 | Cambridge Isotope Laboratories | CLM-409 | |
| [3-3H]-葡萄糖 | PerkinElmer | NET331C001MC | |
| 氘代肉豆蔻酸 | Sigma | 68698 | |
| 十三烷酸 | Sigma | 91988 | |
| 甲氧胺盐酸盐 | Sigma | 89803 | |
| MTBSTFA | Sigma | M-108 | |
| NADH | Sigma | N8129 | |
| 果糖-1,6-二磷酸 | Santa Cruz Biotechnology | sc-214805 | |
| 寡霉素A | Sigma | 75351 | |
| FCCP | Sigma | C2920 | |
| 鱼藤酮 | Sigma | R8875 | |
| 皂苷 | Sigma | S4521 | |
| L-谷氨酸 | Sigma | G1251 | |
| L-苹果酸 | Sigma | M7397 | |
| 琥珀酸 | Sigma | S9512 | |
| TMPD | Sigma | T3134 | |
| L-抗坏血酸 | Sigma | A5960 | |
| 牛血清白蛋白 | Sigma | A2153 | |
| 无脂肪酸BSA | Sigma | SRE0098 | |
| 实验耗材 | CM5传感芯片 | Cytiva | BR100530 |
| 胺偶联试剂盒 | Cytiva | BR100050 | |
| Superdex 200 Increase 10/300 GL | Cytiva | 28990944 | |
| 镍亲和凝胶 | -- | -- | |
| 100 μm细胞筛网 | BD Falcon | -- | |
| 70 μm筛网过滤器 | BD Falcon | -- | |
| 胶原包被培养皿 | Corning | 354456 | |
| 96孔Seahorse XF细胞培养微孔板 | Agilent | -- | |
| Seahorse XFe96传感器卡盒 | Agilent | -- | |
| Seahorse XF校准液 | Agilent | -- | |
| 玻璃底96孔板 | Corning | 3635 | |
| Dounce匀浆器 | Sigma | D9063 | |
| 15毫升锥形管 | -- | -- | |
| 冷冻钳 | -- | -- | |
| 显微注射针 | -- | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 体外醛缩酶活性测定 | 反应体积（0.2 mL或1.8 mL）、醛缩酶来源和浓度（兔醛缩酶50 nM或重组人ALDOA 100 nM）、底物FBP浓度（500 μM）、NADH浓度（0.2 mM）、TPI/GPDH活力单位、反应温度（25°C）、孵育时间（30 min） 阅读提示：Methods: Enzymatic activity |
| 细胞AMPK激活实验 | 细胞类型、aldometanib浓度（5 nM起）、处理时间（2 h）、检测抗体（p-AMPKα T172, p-ACC S79）、细胞裂解液配方 阅读提示：Methods: Immunoprecipitation and immunoblotting; Figure 1f,g |
| 动物体内药效实验 | 动物品系、性别、年龄、给药方式（口服灌胃或饮水）、剂量（2 mpk等）、给药频率和时长、禁食时间、血糖和胰岛素检测时间点 阅读提示：Methods: Rodent strains; Aldometanib treatment in mice and rats; Serology and glucose and insulin tolerance tests |
| 线虫寿命实验 | 线虫品系、生长培养基（NGM）、aldometanib浓度（10 μM）、培养温度（20°C）、L4期开始处理、转移频率（每2天）、死亡判断标准 阅读提示：Methods: Caenorhabditis elegans strains; Evaluation of nematode lifespan and healthspan |
| 小鼠寿命实验 | 小鼠品系（C57BL/6）、年龄（52周龄）、给药方式（饮水100 μg/ml）、每日检查标准（严重濒死判定）、剔除标准（打架、意外等） 阅读提示：Methods: Evaluation of mouse lifespan |