位于刺突蛋白受体结合基序中的隐蔽表位对SARS-CoV-2 Delta变体交叉中和至关重要

The Occluded Epitope Residing in Spike Receptor-Binding Motif Is Essential for Cross-Neutralization of SARS-CoV-2 Delta Variant.

作者信息Weeraya Thongkum, Kanyarat Thongheang, Chatchai Tayapiwatana
PMID35877419
发布时间2022-06-29
DOI10.3390/cimb44070195

实验完整度

包含人体血浆样本的抗体检测(ARCHITECT、NeutraLISA、竞争ELISA)和体外结合实验(间接ELISA、Western blot)及结构分析,但缺乏功能验证(如活病毒中和实验)和动物模型。

主要模型

医护人员血浆样本(n=50)

重点核对

样本:50名泰国医护人员,两剂CoronaVac后BNT162b2加强免疫14天 抗体检测:ARCHITECT i System(Abbott)检测抗RBD IgG 中和抗体:SARS-CoV-2 NeutraLISA(EUROIMMUN)和内部竞争ELISA 单抗:40591-MM43,针对RBD WT、Delta、W436R突变体的结合活性 统计:Spearman和Pearson相关分析,p<0.05为显著

摘要

对SARS-CoV-2 Delta变体出现后疫苗有效性的担忧促使重新审视疫苗设计理念。已开发出单克隆抗体(mAb)来识别刺突蛋白上的中和表位。已证实,诱导中和抗体形成的表位中的关键氨基酸残基不必位于受体结合域(RBD)-血管紧张素转换酶2(ACE2)接触面上,并且可能在构象上是隐藏的。此外,该表位对Delta变体的氨基酸突变具有耐受性。泰国接受两剂CoronaVac后接种一剂BNT162b2加强剂的医护人员中,针对RBD的抗体滴度显著增加。针对Delta变体的中和抗体表明,使用NeutraLISA检测的针对武汉株的总体中和抗体水平与抗RBD抗体水平一致。然而,具有中等抗RBD抗体反应的个体,通过内部竞争性ELISA测定,其与交叉中和mAb克隆40591-MM43竞争的独特抗体群体水平不同。由于40591-MM43 mAb显示出针对Delta变体的交叉中和活性,这一证据表明应改进疫苗接种方案以促进针对Delta变体感染的交叉保护性抗体。40591-MM43 mAb识别的RBD表位在关闭状态下是隐藏的。

实验结论

提炼研究问题、关键发现与证据,快速把握文章的核心贡献。

研究问题
评估泰国医护人员在接种两剂CoronaVac和BNT162b2加强剂后,针对SARS-CoV-2 Delta变体的交叉中和抗体反应,并鉴定隐藏表位的特性。
核心机制
40591-MM43单抗识别的表位位于RBD的受体结合基序(RBM),包含W436残基,在RBD关闭状态下被遮蔽,开放状态下可及,该表位对Delta变体突变耐受但W436R突变降低其结合。
主要证据
通过竞争ELISA和NeutraLISA检测中和抗体,免疫测定显示抗RBD IgG与总中和抗体强相关,但与针对特定表位的抗体相关性较低,间接ELISA显示40591-MM43与WT和Delta结合但与W436R结合减弱,Western blot显示其识别构象表位,结构分析显示W436在关闭状态下溶剂可及性低。
研究意义
研究提示当前疫苗接种方案不足以诱导针对Delta变体交叉保护性表位的抗体,支持基于RBD的疫苗策略以暴露隐蔽表位,实现广谱保护。

研究路径

按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。

1

样本收集与抗体水平检测

评估加强免疫后抗RBD IgG抗体水平

收集50名泰国医护人员血浆,使用ARCHITECT i System检测抗RBD IgG,并按水平分组。

2

中和抗体检测

比较不同方法检测中和抗体水平,评估总体中和抗体和特异性表位抗体

使用SARS-CoV-2 NeutraLISA和内部竞争ELISA检测血浆中和抗体,并进行相关性分析。

3

单抗结合活性检测

验证40591-MM43单抗对RBD WT、Delta和W436R突变体的结合能力

通过间接ELISA和Western blot分析40591-MM43与WT、Delta和W436R RBD蛋白的结合。

4

结构分析

定位关键残基W436在RBD构象中的位置和可及性

使用PDB结构6m0j、7DDD和7DDN,分析RBD与ACE2相互作用残基及W436的溶剂可及性。

研究方法

按研究目的归类文中使用的方法,便于定位所需技术。

检测抗RBD抗体水平
检测单抗结合活性

产品清单

实验环节名称品牌货号
ARCHITECT i系统Abbott--
SARS-CoV-2 NeutraLISAEUROIMMUNEI2606-9601-4
SARS-CoV-2刺突蛋白RBD-His重组蛋白Sino Biological40592-V08H115
刺突中和单克隆抗体(40591-MM43)Sino Biological40591-MM43
HRP偶联山羊抗小鼠免疫球蛋白KPL074-1807
TMB底物Seracare5120-0076
96孔微孔板Greiner Bio-One762071
SARS-CoV-2刺突蛋白RBD-His重组蛋白(WT)Sino Biological40592-V08H115
SARS-CoV-2刺突蛋白RBD-His重组蛋白(Delta)Sino Biological40592-V08H9
SARS-CoV-2刺突蛋白RBD-His重组蛋白(W436R)Sino Biological40592-V08H31
SARS-CoV-2刺突蛋白RBD小鼠多克隆抗体Sino Biological40592-MP01
抗6x His单克隆抗体InvitrogenMA1-21315
KPL LumiGLO®化学发光底物系统Seracare5430-0040
ChemiDoc™ MP成像系统Bio-Rad--
微孔板读数仪Hercuvan Lab Systems--

关键环节

汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。

环节核对要点
样本收集
受试者:泰国医护人员(n=50),两剂CoronaVac后BNT162b2加强,采血时间:第三次接种后14天,EDTA抗凝血浆
阅读提示:Materials and Methods 2.1、2.3
抗RBD抗体检测
ARCHITECT i System (Abbott) 检测IgG,AU/mL
阅读提示:Materials and Methods 2.5、Results 3.1
中和抗体检测
SARS-CoV-2 NeutraLISA (EUROIMMUN) 和内部竞争ELISA(包被RBD-His,血浆1:5,mAb 40591-MM43 2.5 μg/mL)
阅读提示:Materials and Methods 2.6、2.7
单抗结合实验
间接ELISA:包被1 μg/mL RBD蛋白;Western blot:50 μg/mL蛋白,一抗浓度0.5 μg/mL(anti-6x His)或1 μg/mL(40591-MM43)
阅读提示:Materials and Methods 2.8、2.9、Results 3.3、3.5
结构分析
PDB ID: 6m0j, 7DDD, 7DDN;PRODIGY, MISSENSE 3D, UCSF Chimera
阅读提示:Materials and Methods 2.10、Results 3.4