制备EMARS探针并验证刺突蛋白结合
验证SARS-CoV-2刺突蛋白能否有效结合宿主细胞，并用于邻近标记。
使用重组SARS-CoV-2刺突蛋白（S1-RBD-mFc）与HRP偶联的抗小鼠IgG形成EMARS探针。通过免疫细胞化学检测刺突蛋白与Caco-2和A549细胞的结合。
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通过邻近标记和蛋白质组学分析鉴定靠近SARS-CoV-2刺突蛋白附着位点的宿主细胞膜蛋白
Host cell membrane proteins located near SARS-CoV-2 spike protein attachment sites are identified using proximity labeling and proteomic analysis.
实验完整度
高包含EMARS邻近标记与质谱鉴定、免疫共定位验证、电子显微镜验证、假病毒感染实验等多个独立证据层级，并进行了功能验证和机制验证。
主要模型
Caco-2细胞 A549细胞 HEK293T细胞
重点核对
A549和Caco-2细胞中EMARS反应：使用SARS-CoV-2刺突蛋白（0.5 μg/ml）处理30分钟，然后使用HRP标记的抗小鼠IgG（0.25 μg/ml）处理30分钟 Caco-2细胞中候选蛋白与刺突蛋白的共定位：使用共聚焦显微镜和免疫电镜验证 HEK293T细胞稳定转染：P-ACE2细胞通过pCMV3-ACE2转染和潮霉素筛选获得；L-ACE2细胞通过慢病毒转导和嘌呤霉素筛选获得 假病毒感染实验：HEK293T细胞以1.5×10^5 cells/孔与pSARS-CoV-2共培养60小时，GFP阳性细胞（荧光强度≥10^3）作为感染细胞 统计方法：Dunnett's检验用于P-ACE2与共表达细胞比较；Wilcoxon秩和检验用于P-ACE2与P-ACE2-DPP4比较；p≤0.05为显著
摘要
冠状病毒病对全球人口构成真正的威胁，了解致病病毒即严重急性呼吸综合征冠状病毒2（SARS-CoV-2）的生物学特性对于减轻这一威胁至关重要。对参与SARS-CoV-2进入宿主细胞的一级受体和辅助受体（共因子）等蛋白质的分析将为控制病毒提供重要线索。在这里，我们使用邻近标记和蛋白质组学分析，鉴定了靠近SARS-CoV-2刺突蛋白附着位点的宿主细胞膜蛋白候选物。鉴定出的蛋白质代表可能为病毒进入所必需的关键候选因子。我们发现SARS-CoV-2宿主蛋白DPP4、细胞粘附蛋白钙粘蛋白17和糖蛋白CD133与Caco-2细胞中细胞膜结合的SARS-CoV-2刺突蛋白共定位，因此显示出作为候选因子的潜力。此外，我们使用SARS-CoV-2假病毒对HEK293T细胞进行实验感染的分析表明，与单独表达ACE2的HEK293T细胞相比，CD133-ACE2共表达的HEK293T细胞的感染性增强了2倍。关于这些辅助受体标记和分析技术的信息和资源可用于开发针对SARS-CoV-2和其他新兴病毒的抗病毒药物。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- 哪些宿主细胞膜蛋白位于SARS-CoV-2刺突蛋白附着位点附近，并可能参与病毒进入？
- 核心机制
- CD133、CDH17和VAPA与ACE2共表达可增强SARS-CoV-2假病毒的感染性，表明它们作为辅助受体促进病毒进入，但具体分子机制仍不清楚。
- 主要证据
- EMARS邻近标记和质谱鉴定出候选蛋白，免疫共聚焦和电镜证实DPP4、CD133、CDH17、VAPA与刺突蛋白共定位；假病毒感染实验显示共表达候选蛋白的P-ACE2细胞感染率提高2-3倍，单独表达候选蛋白的细胞几乎不感染。
- 研究意义
- 本研究提供了一种识别与病毒附着相关宿主膜蛋白的工具，有助于阐明SARS-CoV-2和其他病毒的进入机制，为开发新型抗病毒治疗药物提供线索。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
EMARS邻近标记和候选蛋白鉴定
标记并鉴定靠近细胞膜上SARS-CoV-2刺突蛋白的宿主膜蛋白。
在Caco-2和A549细胞上进行EMARS反应，使用刺突蛋白和HRP标记的抗小鼠IgG，通过免疫沉淀纯化标记蛋白，并用质谱分析。
候选蛋白与刺突蛋白的共定位验证
验证候选蛋白是否与细胞膜结合的刺突蛋白在空间上共定位。
通过共聚焦显微镜和免疫电镜观察Caco-2细胞中ACE2、CD133、CDH17、DPP4和VAPA与刺突蛋白的共定位。
构建表达ACE2和候选蛋白的稳定细胞系
用于假病毒感染实验，评估候选蛋白对SARS-CoV-2感染的影响。
构建HEK293T细胞单表达ACE2（P-ACE2或L-ACE2），以及共表达候选蛋白（CD133、CDH17、VAPA）和ACE2的细胞系，通过慢病毒转导和抗生素筛选。
SARS-CoV-2假病毒感染实验
评估候选蛋白对SARS-CoV-2假病毒感染效率的影响。
将pSARS-CoV-2（表达GFP）感染单表达或共表达候选蛋白的HEK293T细胞，60小时后通过流式细胞术计数GFP阳性细胞。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
验证分子表达变化
验证免疫效应
数据分析与统计
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 细胞培养 | RPMI 1640培养基 | Wako Chemicals | -- |
| DMEM培养基 | Nacalai | -- | |
| 胎牛血清 | Thermo Fisher Scientific | -- | |
| 非必需氨基酸 | Nacalai | -- | |
| 刺突蛋白标记 | Zenon小鼠IgG HRP标记试剂盒 | Thermo Fisher Scientific | -- |
| 免疫细胞化学 | Alexa Fluor 488偶联单价SARS-CoV-2刺突蛋白 | -- | -- |
| 抗小鼠IgG-Alexa Fluor 488 | Thermo Fisher Scientific | A-11001 | |
| 抗ACE2抗体 | CLOUD-CLONE | PAB886Hu01 | |
| 抗兔IgG-Alexa Fluor 568 | Abcam | ab175471 | |
| 荧光显微镜BZ-700 | Keyence | -- | |
| Western blot | Immobilon-P PVDF膜 | Millipore | -- |
| 抗DPP4抗体 | PROTEINTECH | 10940-1-AP | |
| 抗CD133抗体 | PROTEINTECH | 18470-1-AP | |
| 抗钙粘蛋白17抗体 | PROTEINTECH | 24339-1-AP | |
| 抗VAPA抗体 | PROTEINTECH | 15275-1-AP | |
| 抗GPC3抗体 | Sino Biological | 100393-R024 | |
| HRP偶联抗荧光素抗体 | SouthernBiotech | -- | |
| Immobilon Western化学发光HRP底物 | Millipore | -- | |
| ChemiDoc MP成像系统 | BioRad | -- | |
| 预染蛋白质标记物（宽范围） | Nacalai | 02525-35 | |
| EMARS反应 | HRP偶联霍乱毒素B亚基B | LIST Biological Lab | -- |
| SARS-CoV-2刺突蛋白（S1-RBD） | Sino Biological | 40592-V05H | |
| HRP偶联抗小鼠IgG | Promega | W402B | |
| 荧光素偶联酪酰胺 | -- | -- | |
| 质谱分析 | 测序级胰蛋白酶 | Promega | -- |
| C18 StageTip | GL Sciences | -- | |
| Ultimate 3000 RSLCnano | Thermo Fisher Scientific | -- | |
| LTQ Orbitrap XL质谱仪 | Thermo Fisher Scientific | -- | |
| NIKKYO nano HPLC毛细管柱（3 μm C18，75 μm内径×120 mm） | Nikkyo Technos | -- | |
| C18 PepMap100色谱柱（300 μm内径×5 mm） | Thermo Fisher Scientific | -- | |
| 共聚焦显微镜 | CELLVIEW玻璃底细胞培养皿 | greiner bio-one | -- |
| 抗小鼠IgG-Alexa Fluor 488 | Thermo Fisher Scientific | A-11001 | |
| 抗兔IgG-Alexa Fluor 568 | Abcam | ab175471 | |
| DABCO | Sigma | D2522 | |
| DAPI | Nacalai | 11034-56 | |
| 共聚焦激光扫描显微镜（CellVoyager CV1000） | Yokogawa Electric Corporation | -- | |
| 电子显微镜 | 20 nm金颗粒偶联抗小鼠IgG抗体 | BBI international | EM.GAT10 |
| 10 nm金颗粒偶联抗兔IgG抗体 | BBI international | EM.GAT5 | |
| 超薄切片机（EM UC7） | Leica | -- | |
| 透射电子显微镜（Talos L120） | Thermo Fisher Scientific | -- | |
| 细胞转染 | pCMV3人ACE2 | Sino Biological | HG10108-UT |
| TransIT-2020转染试剂 | Mirus Bio | -- | |
| 慢病毒包装 | pENTR1A no ccDB (w48-1) | Addgene | -- |
| pLenti CMV/TO Puro DEST | Addgene | -- | |
| Gateway LR Clonase酶混合物 | Thermo Fisher Scientific | -- | |
| pMD2.G | Addgene | -- | |
| psPAX2 | Addgene | -- | |
| 0.45 μm滤器 | Sartorius | -- | |
| PCR克隆 | KOD plus DNA聚合酶 | TOYOBO | -- |
| pCMV3人CDH17 | Sino Biological | HG11360-UT | |
| pCMV3人DPP4 | Sino Biological | HG10688-UT | |
| 假病毒感染实验 | pPACK-SPIKE SARS-CoV-2 "S"假型慢病毒载体包装混合物 | SBI | CVD19-500A-1 |
| pLenti CMV/TO eGFP Puro (w159-1) | Addgene | -- | |
| Lenti-X浓缩器 | Clontech | -- | |
| BD FACS Canto II流式细胞仪 | Becton Dickinson | -- | |
| EVOS FLoid细胞成像站荧光显微镜 | Thermo Fisher Scientific | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| EMARS反应 | EMARS探针制备：刺突蛋白浓度（0.5 μg/ml），HRP-抗小鼠IgG浓度（0.25 μg/ml），孵育时间（30分钟），荧光素-酪酰胺浓度（0.05 mM），H2O2浓度（0.0075%），孵育时间（10分钟） 阅读提示：见"EMARS reaction"小节 |
| 质谱分析 | 质谱数据分析：使用Proteome Discoverer 2.2或2.4，搜索Swiss-Prot数据库（Homo sapiens），FDR阈值（严格1%，宽松5%） 阅读提示：见"Proteomic analysis of EMARS products using mass spectrometry analysis"小节和Table S6 |
| 细胞转染 | P-ACE2细胞制备：pCMV3-ACE2转染量（1 μg），TransIT-2020用量（5 μl），潮霉素浓度（150 μg/ml），筛选时间（约2周）；慢病毒转导：病毒液处理时间（3天），嘌呤霉素浓度（2 μg/ml），筛选时间（2周） 阅读提示：见"Preparation of HEK293T transfectant cells"小节 |
| 假病毒感染实验 | 感染条件：细胞数（1.5×10^5 cells/well），病毒液体积（50 μl），感染时间（60小时），GFP阳性阈值（荧光强度≥10^3），计数细胞数（100,000） 阅读提示：见"In vitro infection assay"小节 |
| 统计分析 | 统计方法：Dunnett's检验用于多组比较，Wilcoxon秩和检验用于两组比较，显著性水平（p≤0.05） 阅读提示：见"Data processing"小节 |