体外抗病毒活性验证
确定CBD是否抑制SARS-CoV-2在细胞中的复制
使用A549-ACE2等细胞系，预孵育CBD后感染SARS-CoV-2，检测病毒蛋白表达和病毒滴度
关于丁香通
公司信息
个人用户
企业机构
无忧采购 轻松科研
- 移动端
大麻二酚通过诱导宿主内质网应激和先天免疫反应抑制SARS-CoV-2复制
Cannabidiol inhibits SARS-CoV-2 replication through induction of the host ER stress and innate immune responses.
实验完整度
高研究包含体外细胞感染模型、体内小鼠模型和患者数据分析三个独立证据层级，并进行了机制验证（IRE1α敲除、干扰素中和抗体）。
主要模型
A549-ACE2人肺癌上皮细胞 Calu3人肺癌细胞 Vero E6猴肾上皮细胞 K18-hACE2小鼠模型
重点核对
CBD纯度>97%，来源包括两家化学供应商和两家商业供应商 A549-ACE2细胞以MOI=0.5感染SARS-CoV-2，处理48小时 CBD给药剂量：体外10 μM（EC50约1 μM），小鼠腹腔注射20或80 mg/kg每日两次 小鼠在感染前7天开始给药，感染后继续4天，第5天检测病毒滴度 患者数据分析：1212例CBD100用药患者与匹配对照比较SARS-CoV-2阳性率
摘要
严重急性呼吸综合征冠状病毒2型（SARS-CoV-2）的传播和持续的2019冠状病毒病（COVID-19）大流行凸显了对新疗法的需求。在此，我们报道大麻二酚（CBD）在细胞和小鼠中抑制SARS-CoV-2感染。CBD及其代谢物7-OH-CBD，而非THC或其他测试的同类大麻素，在肺上皮细胞中有效阻断SARS-CoV-2复制。CBD在病毒进入后发挥作用，抑制病毒基因表达并逆转SARS-CoV-2对宿主基因转录的许多影响。CBD部分通过上调宿主IRE1α核糖核酸内切酶内质网（ER）应激反应和干扰素信号通路来抑制SARS-CoV-2复制。在国家COVID队列协作组的配对患者组中，CBD（根据医疗记录为100 mg/ml口服溶液）与SARS-CoV-2阳性检测结果显著负相关。这项研究强调CBD是早期SARS-CoV-2感染的潜在预防剂，值得未来进行临床试验。我们警告不要将非医用制剂用作预防或治疗。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- CBD是否能够抑制SARS-CoV-2复制，并阐明其潜在机制？
- 核心机制
- CBD通过激活宿主IRE1α核糖核酸内切酶活性和干扰素信号通路，诱导内质网应激反应，从而抑制病毒RNA表达和复制。
- 主要证据
- 体外实验显示CBD在A549-ACE2细胞中抑制SARS-CoV-2复制（EC50约1 μM），RNA-seq证实CBD消除病毒RNA并激活IRE1α和干扰素通路；IRE1α敲除和干扰素中和抗体部分减弱CBD的抗病毒作用；小鼠模型中CBD降低肺和鼻甲病毒滴度；患者数据分析显示CBD使用与SARS-CoV-2阳性率降低相关。
- 研究意义
- 研究表明CBD可作为早期SARS-CoV-2感染的潜在预防剂，值得进行未来临床试验，并强调需要进一步研究最佳给药方式和制剂。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
化合物特异性验证
验证CBD特异性，排除其他大麻素的干扰
比较CBD与7-OH-CBD、THC、CBDA、CBDV、CBC、CBG等抗病毒活性，并进行纯度分析
病毒进入后阶段分析
确定CBD作用于病毒复制的哪个阶段
使用假病毒检测进入抑制作用，并在感染后不同时间点添加CBD，检测病毒蛋白表达
转录组分析
揭示CBD对病毒和宿主基因表达的影响
RNA-seq分析感染和CBD处理后的基因表达变化，包括病毒RNA和宿主通路
机制验证
验证IRE1α和干扰素通路在CBD抗病毒作用中的作用
使用IRE1α敲除细胞和干扰素中和抗体，检测CBD的抗病毒效果变化
体内小鼠实验
评估CBD在体内的抗病毒效果
K18-hACE2小鼠腹腔注射CBD每日两次，共11天，感染SARS-CoV-2后检测肺和鼻甲病毒滴度
患者数据分析
评估CBD使用与SARS-CoV-2感染风险的关联
分析N3C数据库中CBD100用药患者的COVID-19阳性率，与匹配对照组比较
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| SARS-CoV-2感染实验 | DMEM培养基 | -- | -- |
| 胎牛血清 | -- | -- | |
| 抗刺突蛋白抗体 | GeneTex | GTX632604 | |
| 细胞培养 | DMEM培养基 | Corning | 10017CV |
| 胎牛血清 | HyClone | SH30910 | |
| 转染 | TransIT-LT1转染试剂 | Mirus | -- |
| 假病毒结合实验 | Hoechst 33342染料 | Thermo Fisher Scientific | H3570 |
| 假病毒中和实验 | SARS-CoV-2刺突蛋白中和抗体 | Sino Biological | 40592-R001 |
| Western blot | Laemmli样品缓冲液 | Bio-Rad | 1610747 |
| 蛋白酶抑制剂 | Roche | 4693159001 | |
| 磷酸酶抑制剂 | -- | GB-450 | |
| ACE2抗体 | Abcam | 108252 | |
| α-微管蛋白抗体 | Invitrogen | MA1-19401 | |
| IRE1α抗体 | Cell Signaling Technology | 3294S | |
| GAPDH抗体 | Cell Signaling Technology | 5174S | |
| 免疫印迹成像 | Li-COR Odyssey Fc成像系统 | Li-COR | -- |
| RNA-seq | 二甲基亚砜 | Sigma-Aldrich | D2650 |
| NucleoSpin 96 RNA试剂盒 | Takara Bio | 740709 | |
| RNA测序 | NovaSeq 6000测序仪 | Illumina | -- |
| qRT-PCR | 高容量cDNA逆转录试剂盒 | Thermo Fisher Scientific | 4368813 |
| PowerUp SYBR Green预混液 | Applied Biosystems | A25776 | |
| LightCycler 96实时荧光定量PCR仪 | Roche | -- | |
| XBP1剪接实验 | XBP1引物 | -- | -- |
| 细胞毒性实验 | Tecan M200酶标仪 | Tecan | -- |
| 干扰素中和实验 | 人IFN-γ抗体 | R&D Systems | MAB285-100 |
| 人I型干扰素中和抗体混合物 | PBL Assay Science | 39000-1 | |
| IRE1α敲除细胞 | lentiCRISPR v2载体 | Addgene | -- |
| 嘌呤霉素 | -- | -- | |
| CBD处理 | CBD粉末 | 供应商D | -- |
| 聚氧乙烯蓖麻油 | Millipore Sigma | 238470 | |
| 磷酸盐缓冲液 | -- | -- | |
| 小鼠病毒滴定 | Vero E6细胞 | ATCC | CRL-1586 |
| 最低必需培养基 | -- | -- | |
| 羧甲基纤维素 | -- | -- | |
| 化合物分离 | 离心分配色谱 | -- | -- |
| NMR | Jeol 600 ECZ-600R核磁共振波谱仪 | Jeol | -- |
| Bruker 600 Avance III核磁共振波谱仪 | Bruker | -- | |
| 氘代甲醇 | -- | -- | |
| 氘代氯仿 | -- | -- | |
| 氘代甲醇 | -- | -- | |
| 细胞系 | A549-ACE2细胞 | -- | -- |
| Vero E6细胞 | ATCC | -- | |
| Calu3细胞 | ATCC | -- | |
| 病毒株 | SARS-CoV-2 nCoV/Washington/1/2020株 | BEI Resources | NR-52281 |
| SARS-CoV-2 α变异株 | BEI Resources | NR-54000 | |
| SARS-CoV-2 β变异株 | BEI Resources | 54009 | |
| SARS-CoV-2 γ变异株 | BEI Resources | 54982 | |
| 动物实验 | K18-hACE2小鼠 | The Jackson Laboratory | 034860 |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 体外抗病毒活性实验 | A549-ACE2细胞在含2% FBS的DMEM中培养；CBD处理2小时；MOI=0.5；感染48小时；检测病毒蛋白和病毒滴度 阅读提示：Methods: SARS-CoV-2 infection assay |
| CBD纯度验证 | CBD纯度>97%；使用qNMR分析；来自四个供应商 阅读提示：Results: High-purity CBD inhibits...; Methods: NMR sample preparation |
| 病毒进入后阶段分析 | A549-ACE2细胞感染2小时；10 μM CBD在感染后2、6、15小时添加；检测spike蛋白 阅读提示：Results: CBD acts at an early step...; Methods: Spike protein and antibody neutralizing assay |
| RNA-seq分析 | MOI=3；10 μM CBD处理24小时；3个生物学重复；RNA提取和测序 阅读提示：Methods: RNA sequencing |
| 机制验证 | IRE1α敲除细胞；干扰素中和抗体（1 μg/ml IFN-γ抗体和1:25混合抗体）；2.5 μM CBD处理 阅读提示：Methods: Generation of IRE1α knockout cells...; Interferon antibody neutralizing assay |
| 小鼠实验 | K18-hACE2雌性小鼠；CBD 20或80 mg/kg腹腔注射每日两次；感染前7天，感染后4天；感染剂量2×10^4 PFU鼻内；第5天检测病毒滴度 阅读提示：Methods: CBD treatment and SARS-CoV-2 challenge in mice |
| 患者数据分析 | N3C数据库；CBD100用药患者（100 mg/ml口服溶液）；匹配对照组；考虑混杂因素 阅读提示：Methods: Analysis of patient data; Patient Data Analysis Supplement |