分子克隆和突变
从水母中克隆荧光蛋白基因，并通过突变改善其亮度和表达。
通过RNA-seq鉴定编码FP的转录本，克隆CU17S，通过随机诱变获得V168A突变体（StayGold）。
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一种高度光稳定且明亮的绿色荧光蛋白
A highly photostable and bright green fluorescent protein.
实验完整度
高包含体外纯化蛋白的光谱与光漂白测定、活细胞成像（WF、SIM、共聚焦）验证光稳定性，并进行了ER、线粒体、微管及病毒蛋白的多层级功能验证。
主要模型
HeLa细胞 COS-7细胞 原代海马神经元 VeroE6/TMPRSS2细胞
重点核对
光漂白实验中使用的光源类型和强度（如5.6 W cm^-2） 蛋白质浓度（如1 μM） 表达FP的细胞类型（如HeLa、COS-7） 成像模式（WF、3D-SIM、共聚焦） SARS-CoV-2感染实验的MOI和固定时间
摘要
荧光蛋白的低光稳定性是荧光显微镜许多应用中的限制因素。在这里，我们介绍了StayGold，一种来源于水螅纲动物Cytaeis uchidae的绿色荧光蛋白（GFP）。StayGold的光稳定性比目前任何可用的荧光蛋白高出一个数量级以上，其细胞亮度与mNeonGreen相似。我们使用StayGold，通过结构化照明显微镜（SIM）对内质网（ER）的动态进行了高时空分辨率、持续数分钟的成像，并观察到比针对ER稳定性优化的GFP变体显著更少的光漂白。利用StayGold融合蛋白和SIM，我们还对线粒体融合和分裂的动态进行了成像，并绘制了感染严重急性呼吸综合征冠状病毒2的固定细胞中的病毒刺突蛋白图谱。由于StayGold是二聚体，我们创建了一个串联二聚体版本，使我们能够观察微管和神经元中兴奋性突触后密度的动态。StayGold将大幅减少光漂白带来的限制，尤其是在活细胞或体积成像中。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- 开发一种具有高光稳定性和高亮度的荧光蛋白，以克服光漂白对活细胞和超分辨成像的限制。
- 核心机制
- StayGold来源于水母Cytaeis uchidae，其高光稳定性可能与特定的氨基酸序列和单点突变（V168A）有关，该突变提高了亮度和表达效率，同时不损害光稳定性。
- 主要证据
- 通过体外纯化蛋白的光漂白实验、活细胞成像（WF、SIM、共聚焦）证明StayGold的光稳定性优于EGFP、mNeonGreen等，并在ER、线粒体、微管和SARS-CoV-2刺突蛋白成像中验证了其应用价值。
- 研究意义
- StayGold将减少光漂白限制，尤其在活细胞或体积成像中，为超分辨成像提供了新的工具。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
体外光稳定性测定
比较StayGold与其他绿荧光蛋白的光稳定性。
纯化蛋白，制备1 μM蛋白胶，在WF照明下测量光漂白曲线，计算t1/2。
活细胞光稳定性验证
检查StayGold在活细胞中的光稳定性。
稳定表达FP的HeLa细胞，在HBSS或DMEM中连续WF成像，测量光漂白。
ER成像应用
展示StayGold在活细胞ER超分辨成像中的应用。
构建靶向ER的StayGold变体（er-(n2)oxStayGold(c4))，在HeLa细胞中表达，进行3D-SIM连续成像观察ER动态。
线粒体成像应用
展示StayGold在活细胞线粒体动态成像中的应用。
构建靶向线粒体的StayGold（mt-(n1)StayGold），在HeLa细胞中表达，进行3D-SIM成像观察融合分裂。
蛋白融合应用
评估StayGold串联二聚体在蛋白标记中的应用。
构建tdStayGold，标记EB3（微管正端）和PSD-95（突触后密度），在COS-7细胞和神经元中成像。
SARS-CoV-2刺突蛋白可视化
利用StayGold融合纳米抗体可视化SARS-CoV-2刺突蛋白。
构建Nb(S1)= =StayGold，感染VeroE6/TMPRSS2细胞，固定后免疫染色，进行WF和3D-SIM成像。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 光谱分析 | U-2910分光光度计 | Hitachi | -- |
| F-2500荧光分光光度计 | Hitachi | -- | |
| 量子产率测量 | C9920-02绝对光致发光量子产率光谱仪 | Hamamatsu Photonics | -- |
| 蛋白浓度测定 | 蛋白质检测染料试剂浓缩试剂盒 | Bio-Rad | 5000006 |
| 超速离心 | Optima XL-A分析超速离心机 | Beckman | -- |
| 细胞培养 | DMEM培养基 | Sigma-Aldrich | -- |
| 胎牛血清 | AusGeneX Pty. Ltd. | -- | |
| 细胞转染 | 脂质体2000 | Thermo Fisher Scientific | 11668027 |
| 光漂白实验 | IX-81显微镜 | Olympus | -- |
| ORCA AG相机 | Hamamatsu Photonics | -- | |
| SIM成像 | N-SIM S显微镜 | Nikon Instruments | -- |
| ORCA FUSION相机 | Hamamatsu Photonics | -- | |
| 转盘共聚焦 | SpinSR10转盘共聚焦系统 | Olympus | -- |
| CSU X1转盘单元 | Yokogawa | -- | |
| iXon Ultra 897 EMCCD相机 | Andor Technology | -- | |
| 流式细胞术 | FACSAria II流式细胞仪 | BD Biosciences | -- |
| SPR | Biacore T200表面等离子体共振仪 | GE Healthcare | -- |
| SARS-CoV-2成像 | Vybrant DyeCycle Ruby染料 | Thermo Fisher Scientific | V10309 |
| DAPI | Fuji Film | 340-07971 | |
| 免疫染色 | 抗ERGIC3抗体 | Abcam | ab129179 |
| 抗Nsp8抗体 | GeneTex | GTX632696 | |
| 抗dsRNA抗体 | Merck | MABE1134-100UL | |
| 抗泛钙粘蛋白抗体 | Sigma-Aldrich | C1821 | |
| Alexa Fluor 555偶联的驴抗兔IgG | Thermo Fisher Scientific | A-31572 | |
| Alexa Fluor 647偶联的驴抗鼠IgG | Thermo Fisher Scientific | A-31571 |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 光漂白实验（纯化蛋白） | 激发光强度（如5.6 W/cm²），蛋白浓度（1 μM），凝胶介质（polyacrylamide gel） 阅读提示：Methods: WF photobleaching (purified protein) |
| 光漂白实验（活细胞） | 细胞类型，培养基（HBSS或DMEM），激发光强度 阅读提示：Methods: WF photobleaching (living cells in HBSS)、WF photobleaching (living cells in DMEM) |
| ER成像 | 细胞系（HeLa），表达构建体（er-(n2)oxStayGold(c4)），成像模式（3D-SIM），光照强度（2.4 W/cm²），帧率（2.6 Hz） 阅读提示：Methods: SIM for live imaging; Figure legends: Fig. 4 |
| 线粒体成像 | 细胞系（HeLa稳定表达mt-(n1)StayGold），成像模式（3D-SIM），光照强度（3.9 W/cm²），帧率（4.4 Hz） 阅读提示：Extended Data Fig. 3; Methods: SIM for live imaging |
| SARS-CoV-2成像 | 细胞系（VeroE6/TMPRSS2），MOI（0.1或0.02），感染时间（24或36小时），Nb(S1)= =StayGold浓度（3.4 μg/ml），固定方式 阅读提示：Methods: Visualizing SARS-CoV-2 S protein in infected cells |