检测健康人和小鼠中的预存S2抗体
评估SARS-CoV-2 S1和S2蛋白交叉反应抗体的预存水平。
使用ELISA和WB检测健康人血浆（2016和2020队列）及SPF小鼠血清中的S1、S2结合抗体，并进行表位作图确定P144。
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靶向SARS-CoV-2 S2的预存抗体与共生肠道细菌交叉反应并影响COVID-19疫苗诱导的免疫
Preexisting antibodies targeting SARS-CoV-2 S2 cross-react with commensal gut bacteria and impact COVID-19 vaccine induced immunity
实验完整度
高包含体外ELISA、WB、表位作图、单抗制备、粪菌移植、小鼠免疫、人体队列分析、宏基因组测序等多个独立实验层级，且有功能验证与机制探索。
主要模型
SPF小鼠（C57BL/6J和BALB/c） 无菌隔离包饲养的小鼠 健康人血浆样本（2016和2020队列） 体外表达SARS-CoV-2 S蛋白的DNA疫苗免疫小鼠模型
重点核对
SPF小鼠与无菌隔离包饲养小鼠的S2抗体水平差异 粪菌移植实验中小鼠P144反应性抗体的诱导 P144特异性单克隆抗体与肠道菌群蛋白（HSP60/HSP70）的交叉反应 DNA疫苗免疫小鼠中预存S2抗体水平对S2特异性抗体应答的影响 人两剂灭活疫苗后预存S2/P144抗体与RBD抗体滴度的相关性
摘要
预存SARS-CoV-2交叉反应抗体的起源及其对疫苗效力的潜在影响尚未完全阐明。在本研究中，我们证明S2是健康人和SPF小鼠中预存S蛋白交叉反应抗体的主要靶标。在S2的连接结构域上鉴定出一个显性抗体表位（1147-SFKEELDKYFKNHT-1160，P144），该表位可被人和小鼠的预存抗体识别。通过宏基因组测序和粪菌移植，我们证明了S2交叉反应抗体的产生与共生肠道细菌相关。此外，从初免SPF小鼠中分离出6种P144反应性单克隆抗体，并证明它们与人和小鼠来源的共生肠道细菌交叉反应。使用LC-MS鉴定了多种交叉反应微生物蛋白，其中大肠杆菌来源的HSP60和HSP70蛋白被证实能与其中一种分离的单克隆抗体结合。具有高水平的预存S2交叉反应抗体的小鼠在接种SARS-CoV-2 S DNA疫苗后产生了更高的S蛋白特异性结合抗体，尤其是针对S2的抗体。同样，我们发现人两剂灭活SARS-CoV-2疫苗接种后，预存S2和P144特异性抗体水平与RBD结合抗体滴度呈正相关。总之，我们的研究揭示了预存S2靶向抗体的另一种起源，并揭示了肠道微生物群对宿主抗SARS-CoV-2免疫影响的一个先前被忽视的方面。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- SARS-CoV-2 S2预存交叉反应抗体的起源及其对COVID-19疫苗免疫原性的影响。
- 核心机制
- 共生肠道细菌（如大肠杆菌HSP60/HSP70）通过分子模拟诱导产生针对S2蛋白P144表位的交叉反应抗体，这些抗体在疫苗免疫后增强S2特异性抗体应答。
- 主要证据
- 通过ELISA和WB检测健康人和SPF小鼠中的S2抗体；宏基因组测序和粪菌移植证明肠道菌群关联；分离单抗与肠道菌群WB和LC-MS鉴定HSP60/HSP70；DNA疫苗免疫小鼠和临床队列分析显示正相关。
- 研究意义
- 研究揭示了预存S2交叉反应抗体的新来源，并提示肠道菌群可能影响COVID-19疫苗免疫应答，为疫苗策略和感染免疫机制提供新见解。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
验证肠道菌群与S2抗体的关联
探究SPF小鼠中预存S2抗体是否由肠道菌群诱导。
比较SPF和无菌隔离包小鼠的S2抗体水平，通过宏基因组测序分析菌群组成，进行粪菌移植实验。
分离P144单克隆抗体并检测交叉反应
获得P144特异性mAb，验证其与肠道菌群蛋白的交叉反应。
从SPF小鼠脾细胞制备杂交瘤，分离6个mAb；用WB检测mAb与肠道菌群裂解物的结合，LC-MS鉴定交叉反应蛋白。
验证HSP60/HSP70与mAb结合
确认E. coli HSP60/HSP70是mAb的交叉反应靶点。
通过ELISA检测mAb与纯化HSP60/HSP70的结合。
评估预存抗体对DNA疫苗免疫应答的影响
评估预存S2抗体水平对DNA疫苗诱导的抗体和T细胞应答的影响。
按预存S2抗体水平将BALB/c小鼠分为低、中、高组，免疫DNA疫苗，检测S1/S2结合抗体、中和抗体、BALF中IgA/IgG、T细胞应答。
分析预存抗体与人灭活疫苗应答的相关性
探索人体预存S2/P144抗体与灭活疫苗诱导的抗体应答的关系。
收集28名健康人接种两剂灭活疫苗前后的外周血，检测RBD结合抗体和中和抗体，进行相关性分析。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
鉴定表位
分析菌群组成
验证菌群与抗体关联
分离单抗
检测抗体亲和力
鉴定交叉反应蛋白
评估中和活性
评估细胞融合
检测B细胞应答
测序与分析
统计与相关性分析
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| ELISA检测 | 高结合力96孔EIA板 | Corning | 9018 |
| SARS-CoV-2 S1蛋白 | Sino Biological | 40591-V08H | |
| SARS-CoV-2 S2蛋白 | Sino Biological | 40590-V08B | |
| 大肠杆菌HSP60 | Prospec | HSP-004 | |
| 大肠杆菌HSP70 | Prospec | HSP-006 | |
| 人HSP60 | Prospec | HSP-016 | |
| 人HSP70 | Prospec | HSP-170 | |
| HRP标记兔抗人IgG抗体 | Abcam | ab6759 | |
| 山羊抗小鼠IgG抗体 | Jackson Immuno Research | 115-035-003 | |
| TMB底物试剂 | MESGEN | MG882 | |
| 800 TS酶标仪 | Biotek | 800TS | |
| MHV检测 | MHV抗体检测试剂盒 | Shanghai Shuangying Biotechnology | SY-M02196 |
| 流式细胞术 | 活/死Zombie Aqua固定活力染料 | Biolegend | 423101 |
| 生物素化S1蛋白 | Sino Biological | 40591-V08H-B | |
| 生物素化S2蛋白 | Sino Biological | 40590-V08B-B | |
| PE抗小鼠CD19 | Biolegend | 152408 | |
| BV785抗小鼠CD45 | Biolegend | 103149 | |
| 链霉亲和素-IF647 | AAT Bioquest | 46006 | |
| BD LSRFortessa流式细胞仪 | BD Biosciences | -- | |
| 单抗制备 | 蛋白A树脂 | -- | -- |
| BCA蛋白定量试剂盒 | Beyotime Biotechnology | P0012 | |
| V(D)J测序 | Trizol试剂 | Invitrogen | R4801-02 |
| SMARTer RACE cDNA扩增试剂盒 | Clontech | 634923 | |
| QIAquick凝胶提取试剂盒 | Qiagen | 28704 | |
| VAHTS通用DNA文库制备试剂盒（Illumina） | Vazyme | ND607 | |
| Illumina Miseq 2x300测序平台 | Illumina | -- | |
| 细菌裂解 | 超声波细胞破碎仪 | Ningbo Scientz Biotechnology | Model |
| Western blotting | PVDF膜 | Millipore | IPVH00010 |
| HRP标记兔抗人IgG抗体 | Abcam | ab6759 | |
| HRP标记山羊抗小鼠IgG抗体 | Jackson Immuno Research | 115-035-003 | |
| 超灵敏ECL底物 | Advansta | K-12045-D10 | |
| 质谱分析 | Microcon PL-10过滤器 | Merck | MRCPRT010 |
| 尿素 | Aladdin | U111898 | |
| 二硫苏糖醇 | Sigma Aldrich | 646563 | |
| 胰蛋白酶 | Sigma Aldrich | T9201 | |
| 甲酸 | Sigma Aldrich | 695076 | |
| 纳流EASYnLC 1200系统 | Thermo Fisher Scientific | -- | |
| Orbitrap Fusion Lumos质谱仪 | Thermo Fisher Scientific | -- | |
| C18分析柱（ReproSil-Pur 120 C18-AQ） | Dr. Maisch GmbH | -- | |
| 自制C18柱 | -- | -- | |
| EASY-nLC 1200 | Thermo Fisher Scientific | -- | |
| Orbitrap Fusion Lumos | Thermo Fisher Scientific | -- | |
| DNA疫苗制备 | 无内毒素质粒纯化试剂盒 | Qiagen | 12391 |
| pJW4303载体 | -- | -- | |
| Sanger测序 | Sangon Biotech | -- | |
| 宏基因组测序 | TIANamp粪便DNA提取试剂盒 | TIANGEN | DP328 |
| NEBNext Ultra DNA文库制备试剂盒 | NEB | E7103 | |
| Agilent 2100生物分析仪 | Agilent | -- | |
| cBot簇生成系统 | Illumina | -- | |
| Illumina Novaseq 6000测序平台 | Illumina | -- | |
| 16s rDNA测序 | NEBNext Ultra DNA文库制备试剂盒 | NEB | E7654 |
| 假病毒中和试验 | Bright-Glo萤光素酶检测系统 | Promega | -- |
| GloMax Navigator微孔板发光检测仪 | Promega | -- | |
| ELISPOT检测 | ELISPOT试剂盒 | BD Bioscience | 551083 |
| BD ELISPOT AEC底物试剂盒 | BD Bioscience | 551951 | |
| ChampSpot III ELISPOT读板仪 | Saizhi | -- | |
| 细胞因子检测 | LEGENDplex细胞因子微球阵列试剂盒 | Biolegend | 741054 |
| 流式细胞术 | BD Fortessa流式细胞仪 | BD Biosciences | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 预存S2抗体检测 | 人类血浆样本来源及年度（2016/2020），小鼠品系及SPF状态，ELISA稀释倍数（1:100），阈值（3倍背景OD），S1/S2蛋白包被浓度（1 μg/ml）。 阅读提示：Materials and methods: 'Plasma samples of healthy human'、'Detection of SARS-CoV-2 S1 and S2 specific binding antibodies'；图1图注 |
| 表位作图 | 肽库设计（18-mer重叠11），竞争肽浓度（5 μg/ml），包被抗原（S2或BSA-P144），竞争肽系列（P144及截短肽），ELISA步骤。 阅读提示：Materials and methods: 'Competitive ELISA'；图1g及图5图注 |
| 粪菌移植 | 抗生素混合物（氨苄青霉素1g/L、甲硝唑0.5g/L、万古霉素0.5g/L、庆大霉素0.5g/L）及葡萄糖36.8g/L，处理14天，2周后接受SPF小鼠新鲜粪便菌群灌胃，检测P144反应抗体。 阅读提示：Materials and methods: 'Metagenomic and 16s rDNA sequencing of mouse gut microbiota'；图2c、d图注 |
| 单克隆抗体制备及交叉反应验证 | 小鼠品系（C57BL/6J、BALB/c），杂交瘤技术细节（融合比例1:10，SP2/0细胞），Western blot中一抗浓度（1 μg/ml），粪便样本处理（约2g，PMSF和超声破碎），LC-MS蛋白鉴定方法（FASP消化等）。 阅读提示：Materials and methods: 'Preparation of P144 specific monoclonal antibodies'、'Isolation of gut commensal bacteria and preparation of whole cell lysate (WCL)'、'Western blotting'、'Mass spectrometry analysis'；图3图注 |
| DNA疫苗免疫 | 小鼠分组标准（低/中/高OD范围），疫苗剂量（50 μg/只），免疫途径（肌肉注射）和时间（0、2、4周），末次免疫后2周检测，检测指标（S2、P144、S1结合抗体，中和抗体，BALF IgG/IgA）。 阅读提示：Materials and methods: 'Mouse vaccination'；图4图注 |
| 人灭活疫苗队列 | 疫苗种类（BIBP-CorV），两剂时间，采血时间点（基线及第二剂后14天），RBD结合抗体ELISA方法，sVNT试剂盒（Suzhou Sym-Bio），相关性分析方法（Spearman）。 阅读提示：Materials and methods: 'Statistical analysis'；图6图注 |