初次免疫与免疫持久性评估
评估INO-4800初免后的体液免疫持久性，并为后续加强免疫提供基线。
恒河猴于第0周和第4周接受1或2 mg INO-4800皮内电穿孔免疫，随后在第35或52周内定期收集血清，通过ELISA和假病毒中和试验检测结合抗体和中和抗体滴度。
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INO-4800与INO-4802的初免-加强免疫方案在非人灵长类中增强并扩大针对SARS-CoV-2的免疫应答。
Prime-boost vaccination regimens with INO-4800 and INO-4802 augment and broaden immune responses against SARS-CoV-2 in nonhuman primates.
实验完整度
中研究在恒河猴中进行了初次免疫和加强免疫，检测了结合抗体、中和抗体、ACE2阻断活性及T细胞反应，但缺乏免疫保护或动物攻毒实验。
主要模型
恒河猴模型
重点核对
初免剂量：1或2 mg INO-4800，于第0周和第4周通过皮内电穿孔给予 加强剂量：1 mg INO-4800或INO-4802，在初免后约一年进行 检测样本：外周血单个核细胞（PBMCs）和血清 中和抗体检测：使用表达ACE2的CHO细胞和SARS-CoV-2假病毒 T细胞反应检测：细胞内细胞因子染色（ICS）
摘要
摘要：SARS-CoV-2新变异株的传播性和免疫逃逸能力增强，要求开发能够在这个不断变化的疫情环境中诱导更强保护的下一代疫苗。由于全球部分人群已通过基于原始武汉-Hu-1 SARS-CoV-2序列的疫苗或自然感染具有一定程度的免疫力，一个重要的后续问题是，针对新变异株的下一代疫苗能否加强这种免疫力，同时维持对现有毒株的长期保护。在此，我们评估了INO-4800（我们正在临床评估中的COVID-19合成DNA疫苗候选物）和INO-4802（一种旨在广泛针对新出现的SARS-CoV-2变异株的下一代DNA疫苗）作为非人灵长类加强疫苗的免疫原性。一年多前用第一代INO-4800疫苗初免的恒河猴，接受INO-4800或INO-4802的同源或异源初免-加强方案加强。两种加强方案均导致T细胞和抗体应答扩大，其特征在于针对野生型SARS-CoV-2及多种关切变异株的中和活性和ACE2阻断活性增强。这些数据说明了INO-4800疫苗接种后免疫的持久性，并支持在初免-加强方案中使用INO-4800或INO-4802。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- 在已有INO-4800初免免疫的恒河猴中，同源或异源加强免疫能否增强并扩大针对SARS-CoV-2变异株的免疫应答？
- 核心机制
- INO-4800和INO-4802加强均能诱导针对多种SARS-CoV-2变异株（包括Omicron）的显著中和抗体反应和ACE2阻断活性，这可能归因于记忆B细胞和T细胞反应的存在。
- 主要证据
- 在恒河猴中，INO-4800或INO-4802加强后，第2周的抗Spike结合抗体滴度显著升高，针对野生型、Alpha、Beta、Gamma、Delta和Omicron假病毒的中和抗体滴度均显著高于加强前，且T细胞反应分析显示CD4和CD8 T细胞分泌IFNγ、IL-2和TNF。
- 研究意义
- 该研究支持INO-4800或INO-4802作为加强疫苗的免疫原性，并可能为临床SARS-CoV-2加强疫苗接种策略提供参考。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
加强免疫与体液免疫评估
评估同源（INO-4800）或异源（INO-4802）加强对结合抗体、中和抗体和ACE2阻断活性的影响。
初免后约一年，将恒河猴随机分为两组，分别接受1 mg INO-4800或INO-4802加强免疫。在加强前（第0周）和加强后第2、4周采集血清，检测针对野生型、Beta、Delta、Gamma和Omicron Spike蛋白的结合抗体滴度、假病毒中和活性和ACE2阻断活性。
加强免疫后细胞免疫评估
评估同源或异源加强后外周血T细胞（CD4和CD8）对SARS-CoV-2刺突蛋白肽库的反应。
在加强后第2周，分离PBMCs，用ancestral或Beta Spike肽库刺激，通过细胞因子染色检测CD4和CD8 T细胞分泌IFNγ、IL-2和TNF的能力。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
验证分子表达变化
数据分析与统计
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 免疫接种 | CELLECTRA 2000® 自适应恒流电穿孔设备 | Inovio Pharmaceuticals | -- |
| 3P阵列 | Inovio Pharmaceuticals | -- | |
| PBMC分离 | 细胞制备管 | BD Biosciences | -- |
| 细胞培养 | RPMI 1640培养基 | Corning | -- |
| 胎牛血清 | Seradigm | -- | |
| 青霉素/链霉素 | Gibco | -- | |
| 细胞处理 | ACK裂解缓冲液 | -- | -- |
| 细胞计数 | ViCell细胞计数器 | Beckman Coulter | -- |
| 细胞冻存 | 二甲基亚砜 | -- | -- |
| 胎牛血清 | -- | -- | |
| 细胞内细胞因子染色 | eBioscience细胞刺激混合物 | Invitrogen | -- |
| GolgiStop | Invitrogen | -- | |
| GolgiPlug | Invitrogen | -- | |
| 抗CD28/CD49d抗体 | -- | -- | |
| 可固定活/死细胞Aqua染料 | Invitrogen | -- | |
| eBioscience Foxp3/转录因子固定/透化试剂盒 | ThermoFisher | -- | |
| ELISA | 重组SARS-CoV-2 S1+S2 ECD蛋白 | Sino Biological | 40589-V08B1 |
| S1蛋白 | Sino Biological | 40591-V08H | |
| S2蛋白 | Sino Biological | 40590-V08B | |
| RBD蛋白 | Sino Biological | 40595-V05H | |
| 重组刺突变异蛋白 | Acro Biosystems | SPN-C52H8, SPN-C52Hc, SPN-C52Hg, SPN-C52He, SPN-C52Hz | |
| 抗猴IgG辣根过氧化物酶结合物 | Bethyl | A140-202P | |
| Biotek Synergy2酶标仪 | Biotek | -- | |
| MSD ACE2抑制试验 | MSD V-PLEX SARS-CoV-2 ACE2中和试剂盒，第5和14组 | Meso Scale Discovery | -- |
| 假病毒中和试验 | 表达ACE2的CHO细胞 | Creative Biolabs | -- |
| Britelite plus报告基因检测系统 | PerkinElmer | -- | |
| 流式细胞术 | CD3抗体 | BD Biosciences | clone SP34-2 |
| CD4抗体 | BD Biosciences | clone L200 | |
| CXCR5抗体 | eBioscience | clone MU5UBEE | |
| PD-1抗体 | BioLegend | clone EH12.2H7 | |
| BD FACS Celesta流式细胞仪 | BD Biosciences | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 动物免疫与样本采集 | 动物：中国恒河猴，5雄4雌，约4岁，体重范围4.48-8.50 kg。初免剂量和方案：1或2 mg INO-4800，第0周和第4周，皮内电穿孔。加强剂量和方案：1 mg INO-4800或INO-4802，初免后约一年（具体周数因动物而异）。 阅读提示：Methods section 'Animal immunizations, sample collection' |
| PBMC隔离和细胞内细胞因子染色 | PBMCs使用CPT管分离，使用ACK裂解缓冲液去除红细胞。ICS刺激条件：1x10^6细胞/样本，肽库或DMSO对照，或PMA/离子霉素刺激，有GolgiStop和GolgiPlug及anti-CD28/CD49d。培养6小时。 阅读提示：Methods section 'Peripheral blood mononuclear cell isolation and intracellular cytokine staining (ICS)' |
| 抗原结合ELISA | 板子包被抗原浓度1 µg/mL，血清稀释系列，孵育时间等。 阅读提示：Methods section 'Antigen binding ELISA' |
| MSD ACE2抑制试验 | 血清稀释1:27。 阅读提示：Methods section 'Meso Scale Discovery ACE2 inhibition assay' |
| 假病毒中和试验 | ACE2-CHO细胞7000个/孔，血清与假病毒孵育90分钟，然后加入细胞，72小时后裂解检测荧光。 阅读提示：Methods section 'Pseudovirus neutralization assay' |