样本采集
快速获取COVID-19死亡患者和对照患者的组织、血液和脑脊液样本。
采用改良的尸检床旁手术程序，包括从枕骨下穿刺抽取脑脊液、从股静脉抽血、内镜引导下采集鼻咽拭子和组织样本，以及通过内镜经鼻筛板入路获取嗅球和额叶组织。
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在死于COVID-19的患者中观察到的脆弱界面上对抗SARS-CoV-2神经侵袭的解剖屏障
Anatomical barriers against SARS-CoV-2 neuroinvasion at vulnerable interfaces visualized in deceased COVID-19 patients.
实验完整度
高研究包含两个独立的患者队列，结合RNAscope、免疫组织化学、共聚焦成像和体外病毒培养等多种方法，并进行了功能验证和机制探讨。
主要模型
尸检组织样本 人类气道上皮细胞培养物 Delta、Omicron BA.1、Omicron BA.2变异株
重点核对
样本来源：COVID-19死亡患者及非感染对照患者 变异株类型：Delta、Omicron BA.1、Omicron BA.2 检测方法：RNAscope、免疫组织化学、共聚焦成像 病毒培养：人呼吸道上皮细胞气液界面培养 样本量：队列II共45例COVID-19患者和8例对照
摘要
SARS-CoV-2能否搭便车于嗅觉投射，并采取一条直接而短暂的路径从鼻子进入大脑？我们认为，如果病毒具有嗜神经性或神经侵袭性，那么在最容易检测到的个体中，应是在感染急性期死亡的患者。在这里，我们应用了一种尸检床旁手术程序，从感染Delta、Omicron BA.1或Omicron BA.2变体的已故COVID-19患者中快速获取组织、血液和脑脊液样本。对经荧光RNAscope和免疫组织化学染色的切片进行共聚焦成像，实现了组织中细胞外SARS-CoV-2病毒粒子的光学显微镜可视化。我们未能找到病毒侵入嗅球和大脑额叶实质的证据。相反，我们识别出了脆弱界面处的解剖屏障，例如嗅觉黏膜固有层中包裹嗅觉轴突束的嗅神经周围成纤维细胞。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- SARS-CoV-2是否能通过嗅觉通路侵入大脑实质，并存在神经侵袭能力？
- 核心机制
- 嗅神经周围成纤维细胞形成解剖屏障，阻止SARS-CoV-2病毒粒子侵入嗅觉轴突束。
- 主要证据
- 通过RNAscope和免疫组织化学在尸检组织样本中可视化病毒粒子，发现病毒粒子未侵入嗅球和额叶实质，且脑脊液样本中未培养出病毒。
- 研究意义
- 该研究提供了SARS-CoV-2无神经侵袭性的证据，并识别了潜在的解剖屏障，对理解病毒传播机制和神经系统保护具有重要意义。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
病毒载量和抗体滴度检测
确认患者处于感染急性期，并评估体液免疫反应。
使用TaqPath qRT-PCR检测鼻咽拭子、血清和脑脊液样本的Ct值，并检测抗S和抗N IgG抗体滴度。
形态学观察
可视化SARS-CoV-2感染细胞、病毒复制和细胞外病毒粒子。
对组织切片进行荧光RNAscope和免疫组织化学染色，使用共聚焦显微镜观察病毒RNA点状信号和蛋白表达。
嗅黏膜和嗅球分析
评估SARS-CoV-2是否侵入嗅黏膜和嗅球实质。
在嗅黏膜和嗅球切片中检测病毒RNA和蛋白，观察嗅神经束和相关细胞类型。
额叶和脑脊液分析
检测SARS-CoV-2是否侵入额叶实质和脑脊液。
在额叶组织切片中检测病毒RNA和蛋白，并对脑脊液样本尝试病毒培养。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 样本采集 | 脊椎穿刺针 | -- | 22 Gauge, 90 mm |
| 内窥镜 | Karl Storz | -- | |
| 快速抗原检测 | Abbott | REF#41FK10 | |
| 样本处理 | 中性缓冲福尔马林 | Sigma-Aldrich | Cat#HT5011 |
| 蔗糖 | Sigma-Aldrich | Cat#S0389-1KG | |
| Tissue-Tek O.C.T.包埋剂 | Sakura | Cat#4583 | |
| Leica CM3050 S恒冷箱切片机 | Leica | -- | |
| RNAscope | RNAscope多重荧光检测试剂盒v2 | Advanced Cell Diagnostics | Cat#323110 |
| RNAscope 4-Plex辅助试剂盒 | Advanced Cell Diagnostics | Cat#323120 | |
| RNAscope靶标修复试剂 | Advanced Cell Diagnostics | Cat#322000 | |
| RNAscope蛋白酶III | Advanced Cell Diagnostics | Cat#322337 | |
| RNAscope过氧化氢和蛋白酶Plus | Advanced Cell Diagnostics | Cat#322330 | |
| Opal 520荧光染料 | Akoya Biosciences | Cat#FP1487001KT | |
| Opal 570荧光染料 | Akoya Biosciences | Cat#FP1488001KT | |
| Opal 690荧光染料 | Akoya Biosciences | Cat#FP1497001KT | |
| RNAscope探针稀释液 | Advanced Cell Diagnostics | Cat#300041 | |
| 免疫组织化学 | Mount Solid抗淬灭封片剂 | abberior | Cat#MM-2011-2X15ML |
| 驴血清 | Sigma-Aldrich | Cat#S30-100ML | |
| DAPI | Thermo Fisher Scientific | Cat#D1306 | |
| 抗水通道蛋白4抗体 | Millipore | Cat#AB3594 | |
| 抗CD31抗体 | Abcam | Cat#ab28364 | |
| GFAP抗体 | Novus Biologicals | Cat#NB300-141 | |
| 细胞角蛋白8抗体 | Novus Biologicals | Cat#NBP2-67468 | |
| MUC5AC抗体 | Thermo Fisher Scientific | Cat#MA5-12178 | |
| SARS-CoV-2核衣壳抗体 | Sino Biological | Cat#40143-R001 | |
| 嗅觉标记蛋白抗体 | FUJIFILM Wako Shibayagi | Cat#544-10001-WAKO | |
| NGFR p75抗体 | Sigma-Aldrich | Cat#N5408 | |
| S100B抗体 | Enzo Life Sciences | Cat#ENZ-ABS307 | |
| SSTR2A抗体 | Biotrend | Cat#NB-49-016-50ul | |
| ZO-1紧密连接蛋白抗体 | Novus Biologicals | Cat#NBP1-85046 | |
| TUBB3抗体 | BioLegend | Cat#801202 | |
| 二抗 | Thermo Fisher Scientific | Cat#A32790, A32794, A32773, A32816, A32795, A32787, A32849 | |
| 病毒培养 | 人气道上皮细胞 | Epithelix | Cat#EP01MD, EP02MP |
| MucilAir培养基 | Epithelix | Cat#EP04MM | |
| NucleoSpin RNA病毒提取试剂盒 | Macherey-Nagel | Cat#740956.50 | |
| iTaq通用探针一步法试剂盒 | Bio-Rad | Cat#1725141 | |
| N基因引物 | IDT Technologies | Cat#10006606 | |
| LightCycler 96 | Roche | -- | |
| QuantStudio 7 Flex | Thermo Fisher Scientific | -- | |
| MagMAX病毒/病原体II试剂盒 | Thermo Fisher Scientific | Cat#A48383 | |
| TaqPath COVID-19 qRT-PCR试剂盒 | Thermo Fisher Scientific | Cat#A48067 | |
| 免疫组织化学 | Zeiss ZEN 2.6系统 | Zeiss | -- |
| Zeiss LSM 800共聚焦显微镜 | Zeiss | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 样本采集 | 患者类型：COVID-19死亡患者和对照；死亡时间；尸检间隔；样本类型 阅读提示：STAR★Methods - Study design and data collection |
| 病毒载量和抗体检测 | qRT-PCR平台、抗体检测平台、样本类型 阅读提示：STAR★Methods - Viral loads and serum antibody titers |
| 形态学观察 | RNAscope探针、抗体、染色条件、显微镜类型 阅读提示：STAR★Methods - RNAscope in situ hybridization and Immunohistochemistry |
| 病毒培养 | 细胞类型：人气道上皮细胞培养；病毒接种；培养条件 阅读提示：STAR★Methods - SARS-CoV-2 growth in culture |