电极表面清洗
清除IDE表面的污染物，以获得干净的基底以进行后续功能化。
IDE用96%乙醇冲洗，并暴露于UV/Ozone 20分钟，然后再次用乙醇冲洗并空气干燥。
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基于电化学阻抗谱的适体传感器对SARS-CoV-2变异株的灵敏检测
Sensitive Detection of SARS-CoV-2 Variants Using an Electrochemical Impedance Spectroscopy Based Aptasensor.
实验完整度
高包含体外缓冲液检测、人鼻液模拟临床样本检测、AFM表面表征及特异性分析等多个独立证据层级，并进行了功能验证和机制探索。
主要模型
叉指金电极（IDE）适体传感器 SARS-CoV-2 S糖蛋白（RBD）重组蛋白 热灭活SARS-CoV-2变异株（Alpha、Delta、Wuhan） 加标人鼻液样本
重点核对
适体浓度：1 µM MCH浓度：3 mM 靶标孵育时间：20 分钟 检测限：S糖蛋白0.4 pg/mL，Delta变异株6.45 ± 0.16 × 10^3 TCID50/mL 鼻液稀释比例：1:1000
摘要
由严重急性呼吸综合征冠状病毒2（SARS-CoV-2）引起的全球大流行对公共卫生构成威胁，并引发世界性危机。这凸显了对快速、有效和灵敏的检测工具的需求，以防止感染的快速传播。因此，本研究旨在开发一种基于电化学阻抗谱（EIS）的适体传感器，采用叉指金电极（IDE）检测SARS-CoV-2刺突（S）糖蛋白和病毒颗粒。这使我们能够灵敏地检测SARS-CoV-2 S糖蛋白，在缓冲溶液中的检测限（LOD）为0.4 pg/mL，并在0.2至0.8 pg/mL的浓度范围内获得线性增加，且具有高特异性。所提出的适体传感器在缓冲溶液中对热灭活的SARS-CoV-2变异株也表现出良好的灵敏度，其中Delta、Wuhan和Alpha变异株分别在病毒滴度为6.45 ± 0.16 × 10^3 TCID50/mL、6.20 × 10^4 TCID50/mL和5.32 ± 0.13 × 10^2 TCID50/mL时被捕获。此外，在加标人鼻液中进行的SARS-CoV-2检测，50 µL样品中Delta变异株的LOD为6.45 ± 0.16 × 10^3 TCID50/mL，检测时间小于25分钟。原子力显微镜图像补充了本研究的EIS结果，揭示IDE在每个修饰步骤后的表面粗糙度增加，表明目标被成功捕获。这种无标记的基于EIS的适体传感器在复杂临床样本中快速检测SARS-CoV-2方面具有广阔的潜力。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- 如何开发一种快速、灵敏、特异的适体传感器，用于检测SARS-CoV-2 S糖蛋白及其变异株？
- 核心机制
- 基于CoV2-RBD-1C适体与SARS-CoV-2 S糖蛋白RBD的特异性结合，引起电极表面电荷转移电阻（Rct）的变化，从而实现电化学阻抗检测。
- 主要证据
- EIS测量显示S糖蛋白浓度在0.2-0.8 pg/mL范围内线性增加，LOD为0.4 pg/mL；对热灭活病毒变异株的检测限分别为Delta 6.45 ± 0.16 × 10^3 TCID50/mL、Wuhan 6.20 × 10^4 TCID50/mL、Alpha 5.32 ± 0.13 × 10^2 TCID50/mL；AFM图像显示每个修饰步骤后表面粗糙度增加，证实目标捕获。
- 研究意义
- 该无标记EIS适体传感器在复杂临床样本中快速检测SARS-CoV-2方面具有潜力，未来可应用于临床样本验证。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
适体固定化
在IDE表面固定巯基修饰的CoV2-RBD-1C适体，以构建识别界面。
巯基修饰的适体（1 µM）与TCEP还原缓冲液混合，加热变性后，将IDE浸入500 µL适体溶液中，室温孵育4小时。
MCH封闭
用MCH封闭未结合的电极表面，以减少非特异性吸附并改善适体取向。
将IDE孵育在500 µL 3 mM MCH溶液中，4°C过夜（16小时）。
靶标检测
检测不同浓度的SARS-CoV-2 S糖蛋白或病毒变异株，并评估传感器的灵敏度。
将50 µL不同浓度的靶标蛋白（0.1-12.8 pg/mL）或病毒变异株（10^1-10^5 TCID50/mL）滴加到功能化的IDE表面，室温孵育20分钟，然后用PBS冲洗，在含有2 mM铁氰化钾/亚铁氰化钾的PBS中测量EIS信号。
特异性分析
评估传感器对非靶标蛋白（MERS-CoV S、HA、HSA）是否有非特异性响应。
将功能化的IDE与0.6 pg/mL的非靶标蛋白孵育20分钟，测量EIS响应变化。
人鼻液样本检测
评估传感器在复杂临床相关基质中的检测性能。
将热灭活Delta变异株以10^1-10^5 TCID50/mL浓度加标到稀释1:1000的鼻液中，取50 µL滴加到IDE表面，孵育20分钟，测量EIS信号。
AFM表面表征
通过AFM成像验证每一步表面修饰和靶标捕获。
在每次修饰和靶标捕获后，对IDE表面进行AFM扫描，并观察捕获的病毒颗粒。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 适体合成 | CoV2-RBD-1C适体 | Eurogentec | -- |
| 靶标蛋白 | SARS-CoV-2刺突RBD重组蛋白 | Sino Biological | 40592-VNAH |
| 特异性检测 | 流感血凝素（HA）肽 | Sigma-Aldrich | I2149 |
| 封闭剂 | 6-巯基-1-己醇 | Sigma-Aldrich | 725226 |
| 缓冲液 | 磷酸盐缓冲液 | Sigma-Aldrich | P4417 |
| 适体还原 | 三(2-羧乙基)膦盐酸盐 | Sigma-Aldrich | C4706-2G |
| 特异性检测 | 人血清白蛋白 | Abcam | ab205808 |
| 临床样本模拟 | 单供体人鼻液 | Innovative Research | IRHUNFSVIAL |
| EIS测量 | PalmSens3阻抗分析仪 | PalmSens BV | -- |
| PSTrace 5.8软件 | PalmSens BV | -- | |
| 电极清洁 | UV/Ozone清洗机 | Bioforce Nanosciences | -- |
| AFM表征 | Smart SPM 1000原子力显微镜 | AIST-NT | -- |
| NSG30_SS悬臂 | TipsNano | -- | |
| AFM图像处理 | Gwyddion 2.60软件 | -- | -- |
| 数据拟合 | EIS频谱分析仪1.0 | -- | -- |
| 数据分析 | OriginLab v.2016 | OriginLab Corporation | -- |
| 统计分析 | GraphPad Prism v.9.1.0 | GraphPad Software | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 表面清洗 | UV/Ozone处理时间：20分钟；溶剂：96%乙醇 阅读提示：参见Materials and Methods，Section 3.4 |
| 适体固定化 | 适体浓度：1 µM；孵育时间：4小时；温度：室温；TCEP处理时间：1小时 阅读提示：参见Materials and Methods，Section 3.5 |
| MCH封闭 | MCH浓度：3 mM；孵育时间：16小时；温度：4°C 阅读提示：参见Materials and Methods，Section 3.5 |
| 靶标检测 | 靶标浓度范围：S糖蛋白0.1-12.8 pg/mL，病毒10^1-10^5 TCID50/mL；孵育时间：20分钟；温度：室温；样品体积：50 µL 阅读提示：参见Materials and Methods，Section 3.6 |
| 人鼻液样本检测 | 鼻液稀释比例：1:1000；Delta变异株浓度范围：6.45 ± 0.16 × 10^1-10^5 TCID50/mL；孵育时间：20分钟 阅读提示：参见Materials and Methods，Section 3.8 |