构建合成噬菌体抗体文库
生成多样化的抗体库以筛选SARS-CoV-2 S1结合抗体
使用来自COVID-19康复者记忆B细胞、人类原始/记忆B细胞、羊驼免疫库的CDR构建了scFv、Fab、VHH四种噬菌体文库，每个库多样性>10^10。
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从大规模合成噬菌体文库中快速发现多样化的SARS-CoV-2中和抗体
Rapid discovery of diverse neutralizing SARS-CoV-2 antibodies from large-scale synthetic phage libraries.
实验完整度
高包含体外结合与中和实验、假病毒和活病毒中和、表位定位、仓鼠感染模型等多项独立验证。
主要模型
Vero E6细胞 Vero细胞（ATCC CCL-81） Vero 76细胞（ATCC） 叙利亚仓鼠模型 HEK-293T细胞
重点核对
噬菌体文库类型及CDR来源 抗体浓度及稀释系列 病毒株（WA1/2020等）及感染剂量 仓鼠模型的免疫抑制处理（环磷酰胺剂量及时间） 给药途径及时间点（如攻毒前12小时或攻毒后6/48小时）
摘要
2019冠状病毒病（COVID-19）是一个不断演变的全球公共卫生危机，需要治疗选择。单克隆抗体（mAbs）的被动免疫代表了一种有前景的治疗策略，能够对SARS-CoV-2感染提供即时保护。在此，我们描述了从四个大规模噬菌体文库中鉴定和表征中和SARS-CoV-2的IgG和VHH抗体。每个文库均通过合成方式构建，CDR环来自天然羊驼和人抗体库并进行了改组。虽然大多数候选抗体靶向SARS-CoV-2刺突蛋白S1亚基的受体结合域，我们也鉴定了一种结合N端域独特表位的中和IgG候选抗体。部分抗体保留了对SARS-CoV-2变异株Alpha、Beta、Gamma、Kappa和Delta的结合能力。总体而言，我们的数据表明，合成噬菌体文库可以快速产生具有治疗所需特征的SARS-CoV-2 S1抗体，包括高亲和力、独特结合位点、体外强效中和活性以及体内限制疾病的能力。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- 如何利用合成噬菌体文库快速发现具有治疗潜力的SARS-CoV-2中和抗体？
- 核心机制
- 多数中和抗体靶向RBD并阻断ACE2结合，部分靶向NTD或隐蔽表位，通过不同机制中和病毒。
- 主要证据
- 通过SPR、竞争ELISA、流式细胞术、假病毒和活病毒中和实验，以及仓鼠模型验证了抗体的亲和力、中和活性和体内保护效果。
- 研究意义
- 合成噬菌体文库能够快速产生针对不同表位的中和抗体，为COVID-19治疗提供候选药物，并支持联合抗体疗法以应对变异株。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
淘选和筛选S1结合抗体
鉴定与SARS-CoV-2 S1蛋白结合的噬菌体展示抗体
使用生物素化S1蛋白进行四轮磁珠淘选，通过噬菌体ELISA筛选结合克隆，并测序获得独特抗体序列。
重组表达与纯化抗体
将筛选出的抗体片段转化为全长IgG或VHH-Fc融合蛋白
将scFv和Fab转化为IgG1，VHH转化为VHH-Fc，在Expi293细胞中瞬时表达，并通过蛋白A亲和纯化。
表征结合亲和力与特异性
测定抗体的结合亲和力、特异性及与ACE2的竞争能力
利用SPR测定抗体对S1和预融合S三聚体的亲和力，通过ELISA和流式细胞术检测抗体对S1与ACE2结合的阻断效果。
评估中和活性
检测抗体对假病毒和真实SARS-CoV-2的中和能力
使用VSV假病毒（D614G）和真实病毒（WA1/2020）进行中和实验，包括PRNT和假病毒荧光素酶检测。
体内疗效验证
在叙利亚仓鼠模型中评估抗体的预防和治疗效果
使用免疫抑制或免疫正常的叙利亚仓鼠模型，先攻毒前给药或攻毒后给药，监测体重变化、病毒载量等指标。
表位定位
确定中和抗体在S蛋白上的结合表位
通过定点突变文库筛选和负染色电子显微镜分析抗体结合的关键氨基酸残基。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 噬菌体文库构建 | 寡核苷酸池 | Twist Bioscience | -- |
| 噬菌体展示 | pADL-22c噬菌粒载体 | Antibody Design Labs | -- |
| 细菌培养 | TG1大肠杆菌细胞 | Lucigen | -- |
| 淘选 | M-280链霉亲和素磁珠 | Thermo Fisher Scientific | -- |
| ELISA | Nunc 384孔板 | Thermo | -- |
| 抗M13-HRP抗体 | Sino Biological | 11973-MM05T-H | |
| 测序 | Sanger测序 | GENEWIZ | -- |
| 克隆 | pTwist CMV BG WPRE Neo载体 | Twist Bioscience | -- |
| 蛋白表达 | Expi293细胞 | Thermo Fisher Scientific | -- |
| 蛋白纯化 | 蛋白A树脂 | PhyNexus | -- |
| 抗体检测 | Acro SARS-CoV-2抑制剂筛选试剂盒 | Acro | EP-105 |
| 亲和力测定 | Carterra LSA SPR生物传感器 | Carterra | -- |
| HC30M芯片 | -- | -- | |
| 蛋白检测 | S1 RBD-mFc重组蛋白 | Acro | SPD-C5259 |
| 流式细胞术 | APC偶联抗小鼠抗体 | -- | -- |
| 表位定位 | SARS-CoV-2 S蛋白定点突变文库 | Integral Molecular | -- |
| Intellicyt iQue流式细胞仪 | Sartorius | -- | |
| AlexaFluor488偶联二抗 | Jackson ImmunoResearch Laboratories | 109-545-003 | |
| Halo Titian电子显微镜 | Thermo Fisher Scientific | -- | |
| IdeS蛋白酶 | Promega | -- | |
| 木瓜蛋白酶 | Sigma | -- | |
| MonoQ柱 | GE | -- | |
| Superdex 6层析柱 | -- | -- | |
| 假病毒中和实验 | VSV假病毒 | -- | -- |
| 活病毒中和实验 | SeaKem ME琼脂糖 | -- | -- |
| CR3022抗体 | -- | -- | |
| 山羊抗人HRP偶联IgG | Sigma-Aldrich | A6029 | |
| TrueBlue检测试剂 | KPL | 5510-0030 | |
| ImmunoSpot 5.0.37 Macro分析仪 | Cellular Technologies | -- | |
| 动物实验 | 环磷酰胺 | -- | -- |
| c7D11抗体 | -- | -- | |
| 试剂 | TMB底物 | -- | -- |
| 链霉亲和素-HRP | -- | -- | |
| 1 M硫酸 | -- | -- | |
| IgG洗脱缓冲液 | Thermo | -- | |
| 皂苷 | Sigma-Aldrich | -- | |
| 正常山羊血清 | Sigma | -- | |
| 甲酸铀酰 | -- | -- | |
| 缓冲液 | HBS-TE缓冲液 | -- | -- |
| 蛋白 | SARS-CoV-2 S1蛋白 (Acro S1N-C82E8) | Acro | S1N-C82E8 |
| S1 WA1蛋白 | Acro | S1N-C52H4 | |
| S1 D614G蛋白 | Acro | S1N-C5256 | |
| S RBD WA1蛋白 | Acro | SPD-C52H3 | |
| S RBD N501Y蛋白 | Acro | SPD-C52Hn | |
| SARS-CoV S1蛋白 | Acro | S1N-S52H5 | |
| S三聚体WA1蛋白 | Acro | SPN-C52H9 | |
| S三聚体B.1.1.7 Alpha蛋白 | Acro | SPN-C52H6 | |
| S三聚体B.1.351 Beta蛋白 | Acro | SPN-C52Hk | |
| S三聚体P.1 Gamma蛋白 | Acro | SPN-C52Hg | |
| S三聚体B.1.617.1 Kappa蛋白 | Acro | SPN-C52Hr | |
| S三聚体B.1.617.2 Delta蛋白 | Acro | SPN-C52He | |
| S RBD N439K蛋白 | Sino Biological | 40592-V08H1 | |
| S RBD K417N蛋白 | Sino Biological | 40592-V08H5 | |
| S RBD E484K蛋白 | Sino Biological | 40592-V08H8 | |
| S RBD Y453F蛋白 | Sino Biological | SPD-C52Hn | |
| S1 HV69-70del N501Y D614G蛋白 | Sino Biological | 40591-V08H7 | |
| S1 HV69-70del Y453F D614G蛋白 | Sino Biological | 40591-V08H8 | |
| 抗体 | SAD-S35抗体 | Acro Biosystems | SAD-S35 |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 噬菌体文库构建 | 文库类型、CDR来源、库多样性（>10^10）、框架序列 阅读提示：Materials and methods：Phage library generation |
| 淘选 | 生物素化S1浓度（100 nM）、淘选轮数（4轮）、洗涤条件 阅读提示：Materials and methods：Panning and screening strategy |
| ELISA筛选 | S1包被浓度、BSA对照、3倍富集标准 阅读提示：Materials and methods：Panning and screening strategy |
| 抗体表达与纯化 | 表达系统（Expi293）、培养体积、纯化方法（蛋白A）、缓冲液 阅读提示：Materials and methods：Reformatting, expression, and purification |
| SPR亲和力测定 | 芯片类型（HC30M）、抗体偶联浓度（10 µg/mL）、分析物浓度、缓冲液（HBS-TE）、温度（25°C） 阅读提示：Materials and methods：SPR affinity measurements |
| 竞争ELISA | RBD包被浓度（0.5 µg/mL）、ACE2浓度（0.12 µg/mL）、抗体浓度范围（100 nM起始）、温度及时间 阅读提示：Materials and methods：Competition ELISA |
| 流式细胞术竞争实验 | Vero E6细胞数（1.5×10^5）、S1 RBD-mFc浓度（0.1 µg/mL）、抗体稀释系列（3倍）、二抗浓度 阅读提示：Materials and methods：Competition ELISA and flow cytometry assays |
| 假病毒中和实验 | 假病毒类型（VSV-D614G）、Vero细胞数（60,000）、抗体稀释系列、孵育时间 阅读提示：Materials and methods：Pseudovirus neutralization assay (IBT) |
| 活病毒中和实验（USAMRIID） | 病毒株（WA1/2020）、Vero 76细胞密度、抗体稀释系列（2倍）、PRNT80终点 阅读提示：Materials and methods：Authentic virus neutralization assay (USAMRIID) |
| 活病毒中和实验（IBT） | 病毒株（WA1/2020）、Vero E6细胞、抗体起始浓度（50 µg/mL）、FFU（100）、甲基纤维素浓度（1%） 阅读提示：Materials and methods：Authentic virus neutralization assay (IBT) |
| 仓鼠预防实验 | 仓鼠周龄和性别（8-10周雌性）、免疫抑制方案（环磷酰胺140 mg/kg，再100 mg/kg）、攻毒剂量（1,000 PFU）、给药时间（攻毒前12小时） 阅读提示：Materials and methods：Evaluation of pre-exposure efficacy |
| 仓鼠治疗实验 | 仓鼠周龄和性别（6-8周）、疫苗剂量（1.5 mg/kg）、给药时间点（6/48, 12/48, 24/72小时）、攻毒剂量（TCID50）、观察时间 阅读提示：Materials and methods：Evaluation of post-exposure efficacy |
| 联合抗体实验 | 抗体剂量（10 mg/kg each）、攻毒剂量（1,000 PFU）、给药时间（D1-D6）、免疫抑制方案 阅读提示：Materials and methods：Evaluation of post-exposure efficacy a cocktail |
| 表位定位 | 突变文库覆盖范围（RBD、NTD）、转染细胞类型（HEK-293T）、抗体浓度、流式细胞仪设置 阅读提示：Materials and methods：Epitope mapping |