单细胞转录组图谱构建与细胞分型
描绘乳腺癌原发肿瘤和配对淋巴结转移肿瘤的细胞组成，并鉴定主要细胞类型。
收集8例乳腺癌患者的配对PT和LNMT组织，制备单细胞悬液，利用10x Genomics 5' mRNA和TCR测序获得转录组和TCR序列，并通过BBKNN整合、UMAP和聚类分析，识别出9大类细胞和40个亚群。
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乳腺癌患者原发肿瘤与配对转移淋巴结肿瘤的单细胞分析
Single cell profiling of primary and paired metastatic lymph node tumors in breast cancer patients.
实验完整度
高包含单细胞转录组和TCR测序、空间转录组、多色免疫组化、体外Transwell迁移实验等多层级验证，并利用TCGA生存数据验证临床意义。
主要模型
8例乳腺癌患者的配对原发肿瘤和淋巴结转移肿瘤组织 THP-1单核细胞 TCGA-BRCA队列
重点核对
8例初治乳腺癌患者，5例管腔型，3例HER2+型 单细胞测序：10x Genomics 5' mRNA和TCR测序 空间转录组：4例患者淋巴结组织，肿瘤细胞比例>50% Transwell迁移实验：PLA2G2A蛋白0.5 μg/ml处理THP-1细胞4小时 多色免疫组化：检测CD8A、CD68、PLA2G2A表达
摘要
淋巴结转移肿瘤（LNMT）的微环境决定肿瘤进展和治疗反应，但目前缺乏对LNMT的系统性研究。在此，我们对8例乳腺癌患者的原发肿瘤（PT）和配对LNMT进行了单细胞图谱分析。我们证明，与PT相比，LNMT中T细胞的活化、细胞毒性和增殖受到抑制。LNMT中的CD4+CXCL13+ T细胞更可能分化为耗竭状态。有趣的是，与PT相比，LNMT中的LAMP3+树突状细胞表现出较低的T细胞启动和激活能力。此外，我们还鉴定出一种在HER2+乳腺癌患者中富集的PLA2G2A+癌症相关成纤维细胞亚型，该亚型可促进免疫浸润。我们还发现，转移淋巴结中恶性细胞的抗原呈递途径下调。总之，我们表征了LNMT和PT的微环境，这可能为乳腺癌淋巴结转移患者的个体化治疗策略提供启示。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- 淋巴结转移肿瘤与配对原发肿瘤在肿瘤微环境组成、免疫细胞功能及机制方面有何差异，以及这些差异如何影响肿瘤转移和免疫治疗策略？
- 核心机制
- 淋巴结转移肿瘤微环境呈现更强的免疫抑制状态，具体表现为T细胞活化、细胞毒性、增殖能力降低，CD4+CXCL13+ T细胞向耗竭状态分化，LAMP3+树突状细胞T细胞启动能力下降，以及恶性细胞下调抗原呈递途径以逃避免疫监视。此外，HER2+乳腺癌中富集的PLA2G2A+癌症相关成纤维细胞通过多种配体-受体相互作用促进免疫细胞浸润。
- 主要证据
- 基于8例乳腺癌配对样本的单细胞RNA和TCR测序分析，结合空间转录组、体外THP-1迁移实验，以及IHC和TCGA数据库验证，证实了LNMT中免疫抑制和PLA2G2A+ CAF的促免疫浸润功能。
- 研究意义
- 该研究系统表征了LNMT与PT微环境的差异，为乳腺癌淋巴结转移患者的个体化治疗策略提供了参考，并可能对免疫治疗应用具有意义。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
T细胞活性与功能分析
比较原发肿瘤和淋巴结转移肿瘤中T细胞的转录状态、发育轨迹、克隆扩增和转迁能力。
对T/NK细胞亚群进行聚类，结合扩散图、PCA、STARTRAC等方法分析CD8和CD4 T细胞的分化轨迹及克隆扩增，并通过配对的TCR分析比较匹配T细胞的基因表达。
髓系细胞特征分析
比较原发肿瘤和淋巴结转移肿瘤中髓系细胞的亚群组成和功能状态，尤其是树突状细胞的成熟和交互能力。
鉴定11个髓系细胞亚群，分析DC亚群在两种组织中的偏好性、STAT1表达、MHC II表达、糖酵解途径富集，以及LAMP3+ DC与免疫细胞的配体-受体相互作用。
PLA2G2A+ CAFs的鉴定与功能验证
鉴定乳腺癌中癌症相关成纤维细胞的亚型，并验证PLA2G2A+ CAFs在HER2+乳腺癌中的免疫浸润促进作用。
基于单细胞数据鉴定CAF亚型，分析CAF亚型在不同乳腺癌分子亚型中的分布，通过细胞间相互作用预测PLA2G2A+ CAFs与免疫细胞的相互作用，利用Transwell实验验证PLA2G2A蛋白对THP-1细胞的趋化作用，并通过IHC和TCGA数据验证其临床相关性。
恶性细胞抗原呈递途径分析
比较原发肿瘤和淋巴结转移肿瘤中恶性细胞的拷贝数变异和抗原呈递相关基因表达差异。
推断上皮细胞的CNV，鉴定恶性细胞，分析PT和LNMT中恶性细胞的差异表达基因，并通过GSEA和单患者及多患者的富集分析，验证抗原呈递途径的下调，进一步通过CNV聚类比较不同克隆的MHC I/II表达。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
验证细胞功能变化
验证机制链路
数据分析与统计
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 单细胞测序 | 10x Genomics Chromium控制器 | 10x Genomics | -- |
| Chromium单细胞5' v1.1试剂盒 | 10x Genomics | -- | |
| 空间转录组 | Visium空间基因表达玻片和试剂盒 | 10x Genomics | -- |
| 测序 | NovaSeq 6000 | Illumina | -- |
| 多重免疫组化 | Absin多重免疫组化试剂盒 | Absin | -- |
| 抗人CD8A抗体 | Abcam | ab17147 | |
| 抗人CD68抗体 | Abcam | ab213363 | |
| 抗人PLA2G2A抗体 | Invitrogen | PA-102403 | |
| 细胞培养 | RPMI-1640培养基 | -- | -- |
| 胎牛血清 | -- | -- | |
| 青霉素 | -- | -- | |
| 链霉素 | -- | -- | |
| Transwell迁移实验 | 24孔细胞培养插件（Costar） | Costar | -- |
| PLA2G2A重组蛋白 | Sino Biological | 11187-H08H |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 样本收集 | 患者亚型、样本数量、治疗史 阅读提示：Methods：Tissue acquisition |
| 单细胞测序 | 测序平台、试剂盒版本、细胞过滤标准、整合参数 阅读提示：Methods：Library construction and sequencing; Single-cell RNA-sequencing data processing |
| TCR分析 | TCR测序引用基因组、双重过滤、克隆型定义、STARTRAC分析样本排除 阅读提示：Methods：T-cell receptor analysis |
| 空间转录组 | 试剂盒版本、测序深度、分析软件参数 阅读提示：Methods：Cell preparation; Library construction and sequencing |
| 免疫组化 | 抗体克隆、稀释倍数、染色步骤、样本量 阅读提示：Methods：Multicolor immunohistochemistry |
| Transwell迁移实验 | 细胞数量、PLA2G2A浓度、处理时间、培养条件 阅读提示：Methods：Transwell assay |