体内鉴定PTENα/β的切割现象
观察PTENα/β在异种移植瘤中的存在形式，发现额外条带并推测切割。
在多种细胞系来源的异种移植瘤中，通过Western blot检测PTENα/β的条带，发现PTENα/β被切割产生FragC和FragN；体外培养细胞中未检测到。
关于丁香通
公司信息
个人用户
企业机构
无忧采购 轻松科研
- 移动端
弗林蛋白酶在细胞外切割分泌型PTENα/β以产生具有肿瘤抑制作用的C端片段
Furin extracellularly cleaves secreted PTENα/β to generate C-terminal fragment with a tumor-suppressive role.
实验完整度
高包含体外切割实验、细胞培养、动物移植瘤模型、患者样本分析及质谱鉴定等多种证据层级，并进行了功能验证和机制验证。
主要模型
SMMC-7721肝癌细胞系 PTEN敲除的SMMC-7721细胞 293T细胞 裸鼠移植瘤模型 肝癌患者配对样本
重点核对
PTENα/β的切割依赖于NTE中的多聚精氨酸序列（残基47-52） 弗林蛋白酶介导切割，FURIN敲低或抑制剂处理减少切割 切割片段FragC不能进入细胞但抑制肿瘤生长 切割抗性PTENα突变体增强肿瘤促进作用 肝癌组织中FragC水平及弗林蛋白酶表达下调
摘要
PTENα和PTENβ（PTENα/β）是磷酸酶和张力蛋白同源物（PTEN）的两种长翻译变体，它们与经典PTEN发挥不同的作用，包括促进癌变和加速免疫抵抗性癌症进展。然而，它们在癌变中的作用仍然未知。在此，我们报道，在分泌到细胞外空间后，PTENα/β蛋白被前蛋白转化酶弗林蛋白酶在其N末端延伸中的多聚精氨酸序列处有效切割，产生一个短的N端片段和一个长的C端片段。虽然分泌的PTENα/β及其切割片段不能进入细胞，但纯化的C端片段（而非切割抗性突变体PTENα）在体内发挥肿瘤抑制作用。因此，过表达切割抗性PTENα突变体表现出比野生型PTENα更显著的促肿瘤作用。与此一致，与配对正常组织相比，肝癌组织中C端片段显著下调，这与弗林蛋白酶表达下调一致。总之，我们表明细胞外PTENα/β对癌变的作用与细胞内PTENα/β相反，并提出PTENα/β的肿瘤抑制性C端片段可能用作治疗癌症的外源性制剂。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- 分泌型PTENα/β在细胞外的作用及其机制如何？
- 核心机制
- 分泌的PTENα/β在细胞外被弗林蛋白酶在NTE的多聚精氨酸序列处切割，产生C端片段FragC，该片段在细胞外发挥肿瘤抑制作用；而细胞内的PTENα/β通过与WDR5互作促进肿瘤发生。
- 主要证据
- 体外切割实验证明弗林蛋白酶切割PTENα；细胞实验和动物移植瘤模型证明FragC抑制肿瘤生长；切割抗性突变体增强促肿瘤作用；临床样本显示肝癌组织中FragC水平降低。
- 研究意义
- 提出细胞外PTENα/β在肿瘤发生中发挥与细胞内相反的作用，FragC可能作为外源性制剂用于癌症治疗。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
鉴定切割位点
确定PTENα/β被切割的具体位置。
通过缺失突变和点突变，确定多聚精氨酸序列（残基47-52）为切割位点，其中R49A或R50,51A突变足以阻断切割。
证实切割发生在细胞外
验证PTENα的切割是否发生细胞外。
将细菌纯化的PTENα与细胞共孵育，检测到切割；转染Flag-PTENα的细胞培养基中检测到FragC和FragN，而细胞裂解液中无。
鉴定切割酶为弗林蛋白酶
确定负责PTENα切割的酶。
纯化的弗林蛋白酶与PTENα孵育产生切割片段；敲低FURIN或使用抑制剂hexa-D-arginine减少切割，过表达Furin增强切割。
鉴定分泌所需元件
确定PTENα/β分泌所必需的NTE序列。
通过缺失突变分析，确定NTE中残基98-108和112-123（PTENβ）或125-135和139-150（PTENα）为分泌所需元件。
评估FragC对肿瘤生长的影响
检验FragC是否具有肿瘤抑制功能。
将纯化的PTENα-WT、PTENα-Δ6R和FragC注射入异种移植瘤，比较肿瘤生长情况。结果显示FragC和PTENα-WT（可被切割）抑制肿瘤生长，而PTENα-Δ6R无效。
分析切割抗性突变体的促肿瘤作用
检验无法切割的PTENα是否增强肿瘤促进作用。
在SMMC-7721ΔPTEN细胞中表达PTENα-WT或切割抗性突变体（R49A、R49K、3RK），皮下接种裸鼠，测量肿瘤体积和重量。结果显示切割抗性突变体比WT更具促肿瘤作用。
检测肝癌样本中PTENα/β切割情况
验证PTENα/β切割在肝癌中的变化。
对20例肝癌及配对正常组织进行Western blot，检测PTENα/β、FragC和Furin水平。发现肿瘤组织中FragC和Furin下调，切割效率降低。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
体内肿瘤模型
临床样本分析
质谱分析
统计与数据分析
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 蛋白检测 | 抗PTEN抗体 | CST | 9559 |
| 抗β-肌动蛋白抗体 | MBL | PM053-7 | |
| 抗FLAG抗体 | Sigma-Aldrich | A8592 | |
| 抗GFP抗体 | Abcam | ab183734 | |
| 抗Akt（泛）抗体 | CST | 4691 | |
| 抗磷酸化Akt（Ser473）抗体 | CST | 4060 | |
| 抗V5抗体 | Abcam | ab182008 | |
| 抗WDR5抗体 | Abcam | ab178410 | |
| 抗S-tag抗体 | Beyotime | AF0285 | |
| 抗弗林蛋白酶抗体 | Abcam | ab183495 | |
| 重组蛋白 | 人血清白蛋白 | Sino Biological | 10968-HNAY |
| 分子克隆 | T4 DNA连接酶 | New England Biolabs | M0202T |
| RNA提取 | TRIzol试剂 | Thermo | 15596026 |
| 逆转录 | MMLV逆转录试剂 | Promega | M1705 |
| 分子克隆 | NEBuilder HiFi DNA组装预混液 | New England Biolabs | E2621L |
| 细胞培养 | DMEM培养基 | -- | -- |
| RPMI-1640培养基 | -- | -- | |
| 胎牛血清 | -- | -- | |
| 蛋白纯化 | BeyoGold His标签纯化树脂 | Beyotime | -- |
| 抗Flag M2亲和凝胶 | Sigma-Aldrich | -- | |
| GFP陷阱 | ChromoTek | -- | |
| 蛋白电泳 | SurePAGE Bis-Tris 4-12%凝胶 | GenScript | -- |
| 蛋白印迹 | 硝酸纤维素膜 | Bio-Rad | -- |
| Immobilon Western化学发光HRP底物试剂盒 | Merck Millipore | -- | |
| 转染 | jetPRIME转染试剂 | Polyplus | -- |
| 蛋白浓缩 | Amicon过滤器（3kD） | Millipore | -- |
| 蛋白表达 | 异丙基β-D-硫代半乳糖苷 | -- | -- |
| 质谱分析 | Orbitrap Fusion LUMOS质谱仪 | Thermo Fisher Scientific | -- |
| Easy-nLC 1200液相色谱 | Thermo Fisher Scientific | -- | |
| ReproSil-Pur 120 A C18-AQ 1.9微米色谱柱填料 | Dr. Maisch GmbH | -- | |
| 蛋白标记 | Alexa Fluor 647蛋白标记系统 | Invitrogen | -- |
| 蛋白递送 | PULSin蛋白递送试剂 | -- | -- |
| 显微镜观察 | Nikon Eclipse TI激光扫描共聚焦显微镜 | Nikon | -- |
| 抑制剂处理 | 六聚D-精氨酸 | -- | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| PTENα/β切割检测 | 细胞系来源、异种移植瘤模型、Western blot检测条件 阅读提示：图1和图S1的图注，或Method Details中'Western blot'部分 |
| 弗林蛋白酶切割 | FURIN敲低或抑制处理条件、切割效率 阅读提示：图3C-E，或Method Details中'In vitro cleavage of PTENα with Furin' |
| 分泌实验 | 分泌元件（残基98-108和112-123） 阅读提示：图4D-E，或Method Details中'Transfection and Secretion determination' |
| 动物肿瘤治疗 | 注射剂量、频率、肿瘤体积测量时间 阅读提示：图5B，或Method Details中'Tumor treatment' |
| 临床样本分析 | 样本数量、配对类型、Western blot定量方法 阅读提示：图6，或Method Details中'Human liver cancer samples' |