NicE-C方法开发与验证
建立并验证一种结合NicE-seq和原位Hi-C的方法，用于高分辨率捕获开放染色质相互作用。
利用Nt.CviPII和DNA聚合酶I对交联染色质进行切割，然后进行末端修复、桥连接头连接，并制备测序文库。
关于丁香通
公司信息
个人用户
企业机构
无忧采购 轻松科研
- 移动端
NicE-C高效揭示与开放染色质相关的染色质相互作用，且具有高分辨率
NicE-C efficiently reveals open chromatin-associated chromosome interactions at high resolution.
实验完整度
高包含方法开发、细胞系和动物组织样本、多种组学验证（NicE-C、RNA-seq、Hi-C、Trac-looping、OCEAN-C比较）以及功能关联分析。
主要模型
HeLa细胞 HeLa-S3细胞 IMR-90细胞 小鼠肾脏组织 CD4+ T细胞 GM12878细胞
重点核对
输入细胞数量：0.1M至1M TNF处理浓度：10 ng/mL TNF处理时间：60分钟 小鼠肾脏：年轻和老年的年龄 测序平台：Illumina NovaSeq
摘要
增强子-启动子通讯已知调控基因表达的时空动态。已有多种方法可用于捕获增强子-启动子相互作用，但它们要么需要大量起始材料且成本高，要么在染色质接触图谱中提供相对较低的分辨率。在此，我们提出了切口酶辅助开放染色质相互作用捕获（NicE-C），该方法利用切口酶介导的开放染色质分析和染色体构象捕获，实现高分辨率下开放染色质相互作用的稳健且经济高效的检测，尤其是增强子-启动子相互作用。使用TNF刺激和小鼠肾脏衰老作为模型，我们应用NicE-C揭示了动态增强子-启动子相互作用的特征。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- 如何开发一种高分辨率、低成本且适用于少量起始材料的方法，以捕获开放染色质相互作用，尤其是增强子-启动子相互作用？
- 核心机制
- NicE-C结合切口酶介导的开放染色质片段化和邻近连接，以捕获开放染色质区域之间的相互作用，其E-P相互作用与转录活性相关，并可能通过环挤压机制（CTCF和TAD边界参与）增强。
- 主要证据
- 通过HeLa、IMR-90和肾脏细胞显示NicE-C可捕获开放染色质峰和E-P/P-P环；与Hi-C和Micro-C比较显示其高分辨率和富集；使用TNF刺激和肾脏衰老模型显示动态E-P环与基因表达变化相关。
- 研究意义
- NicE-C方法适用于有限起始材料（如临床样本）下研究顺式调控元件相互作用的动态，有助于理解疾病病因。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
开放染色质和相互作用图谱比较
评估NicE-C检测开放染色质和染色质相互作用的能力，并与现有方法比较。
将NicE-C数据与NicE-seq、ATAC-seq、Hi-C和Micro-C数据进行比较，分析开放染色质峰、A/B compartments、TADs、染色质环和E-P/P-P相互作用。
不同细胞类型的通用性验证
验证NicE-C在多种细胞类型中的适用性。
对IMR-90细胞和小鼠肾脏细胞进行NicE-C，分析开放染色质峰和E-P/P-P环。
低起始量检测灵敏度评估
评估NicE-C在减少起始材料量时仍能有效捕获E-P环的能力。
比较1M和0.1M HeLa S3细胞的NicE-C数据，检查开放染色质峰和相互作用的相似性。
动态E-P相互作用检测
检测不同细胞状态下E-P相互作用的动态变化。
对TNF刺激或未刺激的HeLa S3细胞，以及年轻或年老小鼠肾脏组织进行NicE-C和RNA-seq，分析差异基因相关E-P相互作用变化。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 细胞培养 | DMEM培养基 | -- | -- |
| 胎牛血清 | -- | -- | |
| 细胞交联 | 甲醛 | Sigma-Aldrich | F8775-500ML |
| 甘氨酸 | Sigma-Aldrich | G8898-1KG | |
| 细胞处理 | 肿瘤坏死因子 | Sino biological | 10602-HNAE |
| 组织解离 | 40微米细胞过滤器 | Sorfa | 251100 |
| NicE-seq/NicE-C | 切口酶Nt.CviPII | NEB | R0626S |
| DNA聚合酶I | NEB | M0209L | |
| 生物素-14-dATP | Jena Bioscience | NU-835-BIO14-S | |
| 生物素-14-dCTP | Jena Bioscience | NU-956-BIO14-S | |
| 5-甲基-dCTP | NEB | N0356S | |
| 蛋白酶K | Thermo Fisher Scientific | EO0492 | |
| HiPure凝胶DNA纯化试剂盒 | Magen | D2111-03 | |
| Dynabeads M-280链霉亲和素磁珠 | Thermo Fisher Scientific | 11205D | |
| VAHTS DNA纯化磁珠 | Vazyme | N411-01 | |
| NicE-C | T4多核苷酸激酶 | NEB | M0201S |
| T4 DNA聚合酶 | NEB | M0203S | |
| Klenow片段 | NEB | M0210S | |
| Klenow外切酶缺陷型 | NEB | M0212S | |
| T4 DNA连接酶 | NEB | M0202S | |
| in situ Hi-C | 十二烷基硫酸钠 | Thermo Fisher Scientific | 24730020 |
| 曲拉通X-100 | Sigma-Aldrich | X100-100ML | |
| MboI限制酶 | NEB | R0147M | |
| RNA-seq | TRIzol试剂 | Invitrogen | 15596018 |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 细胞培养 | 细胞系：HeLa, HeLa-S3, IMR-90；培养条件：DMEM+10%FBS, 37°C, 5% CO2 阅读提示：Methods: Cells and animals |
| 细胞交联 | 交联剂：1%甲醛，室温10分钟；淬灭：125mM甘氨酸，室温10分钟 阅读提示：Methods: Cell treatment and cross-link |
| TNF处理 | TNF浓度：10 ng/mL；处理时间：60分钟 阅读提示：Methods: Cell treatment and cross-link |
| NicE-C | 起始细胞数：1M或0.1M；Nt.CviPII和DNA聚合酶I消化时间和温度；桥连接头序列和连接条件 阅读提示：Methods: NicE-C library preparation |
| in situ Hi-C | 起始细胞数：1M；MboI消化条件（200单位，37°C过夜） 阅读提示：Methods: In situ Hi-C library preparation |
| RNA-seq | 起始细胞数：1M；TRIzol提取 阅读提示：Methods: RNA-seq |
| 数据处理 | 参考基因组：hg19或mm9（文中也验证了hg38/mm10不影响结论） 阅读提示：Methods: Mapping, pairing, and browsing of NicE-C and Hi-C data |