验证IRS-1在细胞内形成液滴
检测IRS-1在细胞中是否形成球形结构并具有液滴特性。
在C2C12、293T、MCF7细胞中过表达GFP标记的IRS-1，使用共聚焦显微镜观察球形结构；通过FRAP、融合实验和CL-EM分析液滴的液体性质和膜结构。
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胰岛素受体底物1的相分离驱动胰岛素/IGF-1信号体的形成
Phase separation of insulin receptor substrate 1 drives the formation of insulin/IGF-1 signalosomes.
实验完整度
高体外纯化蛋白LLPS、细胞模型（C2C12、293T、MCF7）、CRISPR敲除及稳定回补细胞系、免疫共沉淀、FRAP、CL-EM等多层级验证。
主要模型
C2C12成肌细胞及C2C12-IRS-1 KO稳定回补细胞系 HEK293T细胞 体外纯化的重组IRS-1蛋白
重点核对
GFP-mIRS-1表达水平需接近内源水平（通过DOX诱导浓度和时间的优化） FRAP实验中GFP-mIRS-1液滴的激光漂白强度为80%（480 nm） PEG-8000浓度2%（w/v）用于体外LLPS实验 IGF-1刺激浓度为100 ng/mL，胰岛素浓度为100 nM C2C12-IRS-1 KO细胞系通过CRISPR/Cas9靶向IRS-1 N末端序列5'-GCATACTCTTGGGCTTGCGC-3'
摘要
作为胰岛素/IGF信号传导的关键节点，胰岛素受体底物1（IRS-1）对代谢调控至关重要。IRS-1长且无结构的C末端区域招募下游效应分子以促进胰岛素/IGF信号传导。然而，其潜在的分子基础仍不清楚。在这里，我们发现IRS-1的C末端经历液-液相分离（LLPS）。静电和疏水相互作用均驱动IRS-1的LLPS。IRS-1的自结合主要由301–600区域介导，驱动IRS-1的LLPS以形成胰岛素/IGF-1信号体。此外，招募下游效应分子的YXXM基序的酪氨酸残基也有助于IRS-1的自结合和LLPS。IRS-1 LLPS的损伤减弱了其对胰岛素/IGF-1信号的正向作用。代谢疾病相关的G972R突变损害了IRS-1的自结合和LLPS。我们的发现描绘了一种机制，其中IRS-1介导的信号体的LLPS作为胰岛素/IGF-1信号的组织中心，并暗示异常的IRS-1 LLPS在代谢疾病中的作用。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- IRS-1的C末端是否及如何通过相分离形成信号体来调控胰岛素/IGF-1信号传导？
- 核心机制
- IRS-1的C末端通过自结合（主要由301-600区域介导）发生液-液相分离，形成胰岛素/IGF-1信号体，招募下游效应分子p85和Grb2，从而促进信号传导。
- 主要证据
- 体外LLPS实验证明IRS-1形成液滴，细胞实验中GFP-mIRS-1形成具有融合和FRAP恢复特性的液滴；SAR缺失或9YA突变减弱液滴形成和信号传导；G972R突变损害自结合和LLPS，减弱p85和Grb2的招募。
- 研究意义
- 研究揭示了IRS-1相分离作为胰岛素/IGF信号组织中心的机制，并暗示异常的IRS-1 LLPS在代谢疾病（如2型糖尿病）中的作用，为相关疾病的治疗干预提供了新机会。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
体外验证IRS-1的液-液相分离
确定纯化的IRS-1蛋白是否能够独立发生相分离。
纯化FLAG-mIRS-1蛋白，在不同浓度、PEG、温度和盐浓度条件下观察液滴形成；建立相分离图并测定蛋白浓度。
鉴定介导IRS-1相分离的自结合区域
确定IRS-1自结合的关键区域及其在相分离中的作用。
通过截短突变体和共免疫沉淀鉴定SAR区域（301-600），缺失突变体检测液滴形成；体外LLPS验证ΔSAR突变体的相分离能力。
探究胰岛素/IGF信号对IRS-1相分离的动态调控
检测胰岛素/IGF刺激是否影响IRS-1相分离及其酪氨酸磷酸化在其中的作用。
观察IGF-1/胰岛素刺激后IRS-1液滴数量的变化；检测Y608磷酸化与液滴的共定位；纯化刺激后蛋白进行LLPS实验；构建9YA突变体评估其相分离能力。
验证IRS-1液滴招募下游效应分子以形成信号体
证明IRS-1相分离对于招募p85和Grb2并传导胰岛素/IGF信号是必需的。
在体外和细胞中检测p85和Grb2与IRS-1液滴的共定位和相互作用；评估ΔSAR和9YA突变体对信号传导的影响。
评估代谢疾病相关G972R突变对IRS-1相分离的影响
确定G972R突变是否影响IRS-1的相分离和信号传导功能。
纯化hIRS-1和G972R突变体进行体外LLPS；建立稳定细胞系比较液滴形成和信号传导；检测G972R突变对自结合和下游效应分子招募的影响。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
验证样本或模型特征
验证免疫效应
验证机制链路
数据分析与统计
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 细胞培养 | DMEM（高糖） | Hyclone Laboratories | -- |
| RPMI-1640培养基 | Hyclone Laboratories | -- | |
| 胎牛血清 | Hyclone Laboratories | -- | |
| L-谷氨酰胺 | Hyclone Laboratories | -- | |
| 青霉素 | Hyclone Laboratories | -- | |
| 链霉素 | Hyclone Laboratories | -- | |
| 细胞转染 | 脂质体转染试剂2000 | Invitrogen | -- |
| 药物处理 | 胰岛素样生长因子-1 | Sino biological | 10598-HNAY1 |
| 胰岛素 | Sigma | I0305000 | |
| 蛋白质纯化 | 蛋白酶抑制剂混合物 | Selleck Chemicals | B14001 |
| 抗FLAG M2凝胶珠 | Bimake | B23102 | |
| 3x FLAG多肽 | MCE | HY-P0319 | |
| Superdex 200增高型凝胶过滤柱 | GE Healthcare | 28-9909-44 | |
| ND-2000 NanoDrop分光光度计 | Thermo scientific | -- | |
| CRISPR/Cas9敲除 | 慢病毒CRISPR载体v2 | -- | -- |
| 脂质体转染试剂3000 | Thermo Fisher Scientific | L3000015 | |
| 嘌呤霉素 | GPC Biotechnology | AK058 | |
| 诱导型稳定细胞系 | 多西环素 | YEASEN | 60204ES03 |
| 流式分选 | 流式荧光分选仪 | Beckman moflo Astrios EQ | -- |
| 体外相分离实验 | 聚乙二醇8000 | Sangon biotech | A100159 |
| 8孔腔室 | Cellvis | C8-1.5H-N | |
| 1,6-己二醇 | TCI | H0099 | |
| 核糖核酸酶A | Axygen | AP-MD-P | |
| 脱氧核糖核酸酶 | Thermo Scientific | EN0521 | |
| 牛血清白蛋白 | -- | -- | |
| 酶标仪 | Thermo Multiskan Sky | -- | |
| 蛋白质荧光标记 | iFluor 488 NHS酯 | AAT Bioquest | 1023 |
| Microcon-100-kDa离心过滤器 | Millipore | UFC810024 | |
| 显微镜观察 | 蔡司LSM 800共聚焦显微镜 | Carl Zeiss | -- |
| 相关光镜电镜联用 | 聚焦离子束扫描电镜 | Helios UC G3 | -- |
| Western blot | 抗IRS-1抗体 | Cell Signaling Technology | 2382 |
| 抗pAKT S473抗体 | Cell Signaling Technology | 9271 | |
| 抗p85抗体 | Cell Signaling Technology | 4292 | |
| 抗Grb2抗体 | Cell Signaling Technology | 3972 | |
| 抗FoxO1抗体 | Cell Signaling Technology | 2880 | |
| 抗ERK1/2抗体 | Cell Signaling Technology | 9102 | |
| 抗pERK1/2抗体 | Cell Signaling Technology | 4370 | |
| 抗IGF-1Rβ抗体 | Cell Signaling Technology | 9750 | |
| 抗IRβ抗体 | Cell Signaling Technology | 3025 | |
| 抗pIGF-1Rβ Y1135/1136/pIRβ Y1150/1151抗体 | Cell Signaling Technology | 3024 | |
| 抗pIGF-1Rβ Y1131/pIRβ 1146抗体 | Cell Signaling Technology | 3021 | |
| 免疫荧光 | 抗pIRS-1 Y612抗体 | Invitrogen | 44-816G |
| Western blot | 抗AKT抗体 | HUABIO | ET1609-47 |
| 抗GFP抗体 | HUABIO | ET1607-31 | |
| 抗肌动蛋白抗体 | HUABIO | M1210-2 | |
| 免疫荧光 | 抗MHC抗体 | DSHB | MF20 |
| 蛋白质印迹 | 抗FLAG抗体 | YEASEN | 30503ES60 |
| 抗mCherry抗体 | ABclonal | AE002 | |
| Western blot | HRP偶联的山羊抗小鼠二抗 | Jackson | 115-035-003 |
| HRP偶联的山羊抗兔二抗 | Jackson | 111-035-003 | |
| 免疫荧光 | 山羊抗小鼠-Alexa Fluor 546 | Thermo Fisher Scientific | A-11003 |
| 山羊抗兔-Alexa Fluor 488 | Thermo Fisher Scientific | A-11008 | |
| 山羊抗兔-Alexa Fluor 546 | Thermo Fisher Scientific | A-11010 | |
| 山羊抗兔-Alexa Fluor 633 | Thermo Fisher Scientific | A-21071 | |
| 分子克隆 | Axygen质粒小提试剂盒 | Axygen | -- |
| 大肠杆菌DH5-α菌株 | -- | -- | |
| 图像分析 | Imaris软件 | -- | -- |
| Fiji软件 | -- | -- | |
| 统计分析 | GraphPad Prism 8.0.2软件 | GraphPad Software, Inc. | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 细胞培养 | C2C12细胞使用DMEM（高糖）加15% FBS，MCF7使用DMEM加10% FBS，293T使用RPMI-1640加10% FBS、2 mM L-谷氨酰胺、100 U/mL青霉素和100 mg/mL链霉素。 阅读提示：Materials and methods: Culture and maintenance of cells |
| 细胞转染 | 293T细胞使用Lipofectamine 2000转染，C2C12细胞未明确说明转染试剂。 阅读提示：Materials and methods: Culture and maintenance of cells |
| 药物处理 | IGF-1处理浓度100 ng/mL，胰岛素100 nM，处理时间如前所述（2.5分钟、5分钟、15分钟等）。 阅读提示：Materials and methods: IGF-1/insulin stimulation |
| 蛋白质纯化 | FLAG标记蛋白从293T细胞裂解，使用抗FLAG M2凝胶珠纯化，3x FLAG多肽竞争洗脱，凝胶过滤用Superdex 200 increase柱。 阅读提示：Materials and methods: Protein expression and purification |
| CRISPR敲除 | C2C12细胞IRS-1敲除使用lentiCRISPRv2载体，靶向序列为5'-GCATACTCTTGGGCTTGCGC-3'，筛选浓度5 μg/mL嘌呤霉素。 阅读提示：Materials and methods: CRISPR/Cas9 knock-out in C2C12 cells |
| 诱导型稳定细胞系 | 使用tet-on系统，HP216和HP138载体，多西环素诱导浓度500 ng/mL。 阅读提示：Materials and methods: Generation of inducible stable cell line |
| 体外相分离实验 | 缓冲液组成：50 mM Tris-HCl pH 7.5, 10%甘油, 1 mM DTT, 2% PEG-8000, NaCl浓度根据实验调整。 阅读提示：Materials and methods: In vitro phase separation assays |
| FRAP | GFP-mIRS-1使用80%激光强度（480 nm），iFluor 488标记蛋白使用100%激光强度。 阅读提示：Materials and methods: Fluorescence recovery after photobleaching (FRAP) |
| 免疫沉淀和Western blot | 裂解缓冲液成分，抗FLAG M2珠免疫沉淀，SDS-PAGE和特定抗体检测。 阅读提示：Materials and methods: Immunoprecipitation studies and Western blot analyses |
| 免疫荧光 | PBSCM缓冲液，3%多聚甲醛固定，0.1%皂素透化，抗体稀释液含7% FBS和2% BSA。 阅读提示：Materials and methods: Immunofluorescence and direct fluorescence studies |
| 图像分析 | 球形度、体积和数量使用Imaris软件，3D渲染步长0.12 µm。 阅读提示：Materials and methods: Three-dimensional (3D) rendering, sphericity, volume and number measurement |
| 统计分析 | 统计检验方法选择基于正态性检验，双尾非配对Student t检验、Mann-Whitney检验或ANOVA。 阅读提示：Materials and methods: Statistical analysis |