验证InlA包被珠的E-钙粘蛋白依赖性内化
确认InlA包被珠作为工具能特异性地模拟InlA介导的侵入，且依赖于E-钙粘蛋白。
制备InlA包被乳胶珠，与野生型MCF10A和CDH1敲除MCF10A细胞孵育，检测内化效率；与BSA、GST包被珠对比。
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单核细胞增生李斯特菌劫持宿主外泌复合体促进内化素A介导的侵入
Listeria monocytogenes Co-Opts the Host Exocyst Complex To Promote Internalin A-Mediated Entry.
实验完整度
高体外细胞模型（Caco-2、MCF10A）结合InlA包被珠摄取实验、VAMP3-EGFP胞吐检测、RNAi敲低外泌复合体亚基、NSF抑制肽处理及表面生物素化分析，包含功能验证和机制验证。
主要模型
Caco-2肠上皮细胞系 MCF10A乳腺上皮细胞系（E-钙粘蛋白表达与敲除）
重点核对
InlA包被乳胶珠（3μm）与Caco-2细胞共孵育时间：15分钟（胞吐检测）或30分钟（内化检测） TAT-NSF700肽处理浓度：10 μM，处理时间：20分钟（胞吐）或45分钟（内化） siRNA敲低Exo70、Exo84、Sec6的浓度为100 nM，转染后约72小时进行内化检测 表面生物素化使用EZ-Link Sulfo-NHS-SS-Biotin（10 mM），4°C处理30分钟
摘要
细菌病原体单核细胞增生李斯特菌通过其表面蛋白内化素A（InlA）与人细胞间粘附分子E-钙粘蛋白相互作用，诱导其内化（侵入）进入肠上皮细胞。虽然InlA介导的侵入需要细菌刺激肌动蛋白聚合，但宿主是否还操纵其他过程以促进内化仍不清楚。在此，我们表明InlA与E-钙粘蛋白的相互作用诱导了宿主膜运输过程——极性胞吐，该过程增强了李斯特菌的摄取。成像研究显示，胞吐在InlA依赖性内化位点被刺激。抑制人N-乙基马来酰亚胺敏感因子（NSF）的实验表明，胞吐是有效的InlA介导侵入所必需的。极性胞吐由外泌复合体介导，该复合体包含八个蛋白，包括Sec6、Exo70和Exo84。我们发现Exo70被招募到InlA介导的侵入位点。此外，通过RNA干扰耗竭Exo70、Exo84或Sec6会损害侵入，而不影响E-钙粘蛋白的表面水平。与InlA结合E-钙粘蛋白类似，E-钙粘蛋白分子的同嗜性相互作用动员了外泌复合体并刺激了胞吐。总之，这些结果表明E-钙粘蛋白的连接诱导胞吐，从而促进李斯特菌侵入，并提出了外泌复合体也可能控制E-钙粘蛋白在细胞间粘附中的正常功能的可能性。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- 李斯特菌InlA介导的侵入是否劫持宿主极性胞吐过程，以及外泌复合体是否参与此过程。
- 核心机制
- InlA与E-钙粘蛋白结合后，招募外泌复合体（如Exo70）到侵入位点，刺激极性胞吐，从而促进李斯特菌的内化。
- 主要证据
- InlA包被珠诱导VAMP3-EGFP标记的胞吐，Exo70-EGFP聚集，抑制NSF活性或敲低Exo70、Exo84、Sec6显著减少内化，且不影响E-钙粘蛋白表面水平。
- 研究意义
- 揭示了E-钙粘蛋白连接诱导胞吐促进李斯特菌侵入，提示外泌复合体可能也参与E-钙粘蛋白在细胞粘附中的正常功能。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
检测InlA介导的侵入是否诱导极性胞吐
探究InlA包被珠是否在宿主细胞侵入位点刺激胞吐。
使用表达VAMP3-EGFP的Caco-2细胞，孵育InlA包被珠15分钟，通过抗EGFP抗体标记外表面VAMP3-EGFP，量化富集倍数。
验证NSF活性对InlA介导侵入的作用
确定通过NSF抑制胞吐是否能减少InlA包被珠的内化。
用TAT-NSF700肽处理Caco-2细胞，随后检测胞吐和内化，并评估细胞活力。
检测外泌复合体亚基的招募
确定外泌复合体是否被招募到InlA介导的侵入位点。
在Caco-2细胞中表达EGFP-Exo70，与InlA包被珠孵育15分钟，通过共聚焦显微镜观察EGFP-Exo70的聚集。
评估外泌复合体亚基在侵入中的功能作用
通过RNAi敲低外泌复合体亚基，检测对InlA包被珠和细菌侵入的影响。
用siRNA敲低Exo70、Exo84、Sec6等，通过Western blot验证敲低效率，检测InlA包被珠内化和李斯特菌侵入。
检测NSF抑制或外泌复合体敲低对E-钙粘蛋白表面水平的影响
排除胞吐抑制通过减少表面E-钙粘蛋白而影响侵入的可能性。
运用表面蛋白生物素化方法，检测TAT-NSF700处理或siRNA敲低外泌蛋白后E-钙粘蛋白的表面水平。
检测E-钙粘蛋白的同嗜性相互作用是否诱导胞吐和颗粒内化
确定E-钙粘蛋白的同嗜性连接是否也激活类似InlA的胞吐和外泌复合体动员。
使用包被E-钙粘蛋白胞外域（ECD）的珠，检测胞吐、Exo70招募和内化，并验证NSF和siRNA对其的影响。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 细胞培养 | 含4.5 g/L葡萄糖和2 mM谷氨酰胺的DMEM | Life Technologies | 11995-065 |
| 人转铁蛋白 | Sigma-Aldrich | T8158 | |
| 胎牛血清 | -- | -- | |
| G418 | -- | -- | |
| 抗体 | 抗E-钙粘蛋白抗体 | Abcam | ab15148 |
| 抗GST抗体 | Sigma-Aldrich | G7781 | |
| 抗EGFP抗体 | Roche | 1181460001 | |
| 抗Exo70抗体 | Kerafast | D2001 | |
| 抗Exo84抗体 | Santa Cruz Biotechnology | sc-5515532 | |
| 抗Sec3抗体 | Sigma-Aldrich | HPA037706 | |
| 抗Sec5抗体 | Kerafast | ED2002 | |
| 抗Sec6抗体 | Santa Cruz Biotechnology | sc-374054 | |
| 抗Sec8抗体 | Becton Dickenson | 610658 | |
| 抗Sec10抗体 | Abcam | ab241472 | |
| 抗Sec15抗体 | Kerafast | ED2003 | |
| 抗微管蛋白抗体 | Sigma-Aldrich | T5168 | |
| Western blot | 辣根过氧化物酶标记的二抗 | Jackson ImmunoResearch | -- |
| Bio-Rad Clarity Max Western ECL底物 | Bio-Rad | -- | |
| Odyssey成像系统 | Li-Cor Biosciences | -- | |
| 药物处理 | TAT-NSF700肽 | AnaSpec | -- |
| TAT肽 | AnaSpec | -- | |
| 二甲基亚砜 | -- | -- | |
| 拉特伦库林A | Sigma-Aldrich | L5163 | |
| 重组蛋白 | 重组InlA蛋白（6xHis标记） | -- | -- |
| 纯化E-钙粘蛋白ECD-Fc融合蛋白 | Sino Biological | 10204-H02H | |
| 谷胱甘肽S转移酶 | -- | -- | |
| 牛血清白蛋白 | Thermo Fisher Scientific | 23225 | |
| siRNA转染 | Lipofectamine RNAiMax转染试剂 | Life Technologies | -- |
| Lipofectamine 2000转染试剂 | Life Technologies | -- | |
| siRNA寡核苷酸 | Sigma-Aldrich / Dharmacon | -- | |
| 珠子偶联 | 羧基修饰乳胶珠 | Polysciences | 09850 |
| 表面生物素化 | EZ-Link Sulfo-NHS-SS-生物素 | Thermo Fisher Scientific | 21331 |
| 链霉亲和素-琼脂糖珠 | Sigma-Aldrich | 85881 | |
| 蛋白A/G琼脂糖 | Santa Cruz Biotechnology | -- | |
| 蛋白纯化 | His-Bind树脂 | MerckMillipore | -- |
| HiTrap Q柱 | GE Healthcare | -- | |
| 细胞培养 | 脑心浸液肉汤 | Difco | -- |
| 细菌感染 | 庆大霉素 | -- | -- |
| 显微镜 | FV1200激光扫描共聚焦显微镜 | Olympus | -- |
| 统计分析 | Prism软件 | GraphPad Software | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 细胞培养 | Caco-2亚克隆BBE1（ATTC CRL-2102）的培养条件（DMEM高糖、谷氨酰胺、转铁蛋白、FBS、青霉素-链霉素），VAMP3-EGFP稳定细胞系需G418筛选。 阅读提示：见Materials and Methods中的'Bacterial strains, mammalian cell lines, and media'部分。 |
| 珠子偶联 | InlA、BSA、GST或E-cadherin ECD与羧基修饰乳胶珠（直径3 μm）的共价偶联方法。 阅读提示：见Materials and Methods中的'Coupling of proteins to latex beads'部分。 |
| 胞吐检测 | VAMP3-EGFP外表面标记步骤：无透化条件下抗EGFP抗体孵育浓度和时间（1:50，4°C，45分钟）。 阅读提示：见Materials and Methods中的'Confocal microscopy analysis'部分。 |
| 内化测定 | 珠子与细胞比例（约5:1）、离心促进结合（1,000 rpm，2分钟）、孵育时间（30分钟）和胞外珠子标记方法（透化前抗体标记）。 阅读提示：见Materials and Methods中的'Quantification of internalization of beads'部分。 |
| NSF抑制 | TAT-NSF700或TAT肽使用浓度（10 μM）、处理时间（20分钟或45分钟）和对照条件（未处理或DMSO）。 阅读提示：见Materials and Methods中'Quantification of internalization of beads'和'Cell surface biotinylation studies'相关部分。 |
| siRNA敲低 | siRNA序列、浓度（100 nM）、转染试剂（Lipofectamine RNAiMax）和转染时间（约72小时）以确保敲低效率。 阅读提示：见Materials and Methods中的'siRNAs'和'Transfection'部分。 |
| 表面生物素化 | EZ-Link Sulfo-NHS-SS-Biotin浓度（10 mM）、4°C处理时间（30分钟）、淬灭步骤（20 mM甘氨酸）和裂解缓冲液成分。 阅读提示：见Materials and Methods中的'Cell surface biotinylation studies'部分。 |
| 细菌侵入 | 李斯特菌株（BUG 1047和BUG 949）的感染复数（MOI约30:1）、感染时间（1小时）和庆大霉素浓度（20 μg/mL）及处理时间（2小时）。 阅读提示：见Materials and Methods中的'Bacterial entry assays'部分。 |