建立ACE2/CMC筛选模型
筛选黄芩中能够结合ACE2受体的潜在配体。
制备ACE2细胞膜固定相并填充CMC色谱柱，用于分析黄芩提取物及已知成分（包括黄芩素A、汉黄芩素、野黄芩苷和黄芩新素）的保留行为。
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黄芩素A是一种通过血管紧张素转换酶II/细胞膜色谱法从黄芩中获得的严重急性呼吸综合征冠状病毒2型刺突假病毒阻断剂
Oroxylin A is a severe acute respiratory syndrome coronavirus 2-spiked pseudotyped virus blocker obtained from Radix Scutellariae using angiotensin-converting enzyme II/cell membrane chromatography.
实验完整度
中文献包含ACE2/CMC筛选、分子对接、SPR结合实验、假病毒入侵抑制实验及自噬和凋亡检测，但缺乏体内实验验证。
主要模型
HEK293T细胞稳定表达ACE2（ACE2细胞） SARS-CoV-2刺突假病毒 ACE2/CMC色谱模型
重点核对
黄芩素A在ACE2/CMC中的保留时间（10.90分钟） 黄芩素A对ACE2细胞的IC50值（164.6 μM） 黄芩素A抑制SARS-CoV-2刺突假病毒进入ACE2细胞的浓度依赖性（10和20 μM） 分子对接中黄芩素A与ACE2的氢键相互作用 SPR测定中黄芩素A与ACE2的结合KD值（9.72×10⁻⁶ M）
摘要
当前全球范围内爆发的2019冠状病毒病（COVID-19）已被宣布为公共卫生紧急事件。据报道，血管紧张素转换酶II（ACE2）是严重急性呼吸综合征冠状病毒2型（SARS-CoV-2，COVID-19的致病病毒）的主要宿主细胞受体。在本研究中，我们从黄芩（Radix Scutellariae）中筛选ACE2配体，并研究了其对SARS-CoV-2刺突假病毒在体外的抑制作用。使用稳定表达ACE2受体的HEK293T细胞（ACE2细胞）为ACE2/细胞膜色谱法（CMC）分析提供受体。使用SARS-CoV-2刺突假病毒检测筛选出的化合物在ACE2细胞中的抗病毒入侵作用。使用分子对接和表面等离子体共振（SPR）测定确定结合特性。黄芩素A对SARS-CoV-2刺突假病毒进入ACE2细胞表现出明显的抑制作用，并通过SPR和CMC测定显示其与ACE2具有良好的结合能力。研究表明，黄芩素A通过特异性结合ACE2受体，阻断SARS-CoV-2进入ACE2细胞，是治疗COVID-19的潜在候选药物。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- 黄芩中的化合物能否通过靶向ACE2受体阻断SARS-CoV-2进入细胞？
- 核心机制
- 黄芩素A通过特异性结合ACE2受体，阻断SARS-CoV-2刺突假病毒进入ACE2细胞，从而抑制病毒感染。
- 主要证据
- 基于ACE2/CMC筛选、分子对接、SPR结合实验以及SARS-CoV-2刺突假病毒入侵抑制实验，结果均证实黄芩素A与ACE2结合并有效阻断病毒进入。
- 研究意义
- 黄芩素A是治疗COVID-19的潜在候选药物，为开发针对ACE2的病毒进入抑制剂提供了新的方向。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
评估化合物对ACE2细胞的毒性
确定黄芩素A等化合物在ACE2细胞中的安全浓度范围，以避免毒性影响后续实验。
使用CCK-8实验检测不同浓度化合物处理ACE2细胞24小时后的细胞活力，并通过流式细胞术检测黄芩素A处理后的细胞凋亡。
检测SARS-CoV-2刺突假病毒进入抑制效果
评估化合物抑制SARS-CoV-2刺突假病毒进入ACE2细胞的能力。
ACE2细胞与化合物预孵育后，加入SARS-CoV-2刺突假病毒，通过检测荧光素酶活性反映病毒进入效率。氯喹作为阳性对照。
验证黄芩素A对自噬的影响
探讨黄芩素A是否通过调节自噬发挥抗病毒作用。
通过免疫荧光和Western blot检测黄芩素A处理后ACE2细胞中LC3蛋白的表达变化。
分析黄芩素A对细胞内钙离子动员的影响
排除黄芩素A通过诱导钙内流发挥作用的可能性。
使用钙成像缓冲区（CIB）和Fluo-3 AM荧光探针检测黄芩素A处理前后ACE2细胞和HEK293T细胞的钙内流变化。
评估黄芩素A与ACE2的结合能力
通过分子对接和SPR实验验证黄芩素A与ACE2的特异性结合。
使用分子对接预测黄芩素A与ACE2的结合模式，并通过SPR实验测定结合动力学和亲和力。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 细胞培养 | ACE2-HEK293T细胞 | Genomeditech | GM-CS-108841 |
| 高糖DMEM培养基 | HyClone | SH30022.01 | |
| 胎牛血清 | HyClone | 16140071 | |
| 青霉素-链霉素溶液 | Xi'an Hat Biotechnology Co., Ltd. | -- | |
| 细胞凋亡 | 膜联蛋白V-FITC/PI凋亡检测试剂盒 | 7Sea Pharmatech Co., Ltd. | A005-3 |
| 细胞活力 | CCK-8试剂盒 | 7Sea Pharmatech Co., Ltd. | -- |
| 假病毒入侵 | SARS-CoV-2刺突假病毒 | Sino Biological | PSV001 |
| 蛋白质提取 | RIPA裂解液 | -- | -- |
| 蛋白酶和磷酸酶抑制剂混合物 | Roche Diagnostics | -- | |
| Western blot | PVDF膜 | Hangzhou Microna Membrane Technology Co., Ltd. | -- |
| 抗LC3抗体 | Proteintech Group Inc. | 14600-1-AP | |
| 抗GAPDH抗体 | CST | #2118 | |
| 免疫荧光 | TRITC标记的鬼笔环肽 | Yeasen | 40734ES75 |
| CoraLite488标记的山羊抗兔IgG（H+L） | Proteintech Group Inc. | SA00013-2 | |
| DAPI-氟保存封片剂 | Pioneer Biotechnology | 0100-20 | |
| Western blot | 5×上样缓冲液 | Thermo Fisher Scientific, Inc. | -- |
| 增强化学发光试剂盒 | Proteintech Group, Inc. | -- | |
| 钙成像 | Fluo-3 AM酯 | Biotium | -- |
| Pluronic F-127 | Biotium | -- | |
| 化合物处理 | 黄芩素A | Chengdu Pufeide Biotech Co., Ltd. | -- |
| 汉黄芩素 | Chengdu Pufeide Biotech Co., Ltd. | -- | |
| 野黄芩苷 | Chengdu Pufeide Biotech Co., Ltd. | -- | |
| 黄芩新素 | Chengdu Pufeide Biotech Co., Ltd. | -- | |
| 分子对接 | Sybyl-X程序 | New Tripos International | -- |
| SPR | Open SPR™ | Nicoya Lifesciences | -- |
| TraceDrawer软件 | -- | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| ACE2/CMC筛选 | ACE2细胞数量、硅胶量、色谱柱尺寸、流动相、流速、柱温、进样量 阅读提示：Methods 2.2, 2.3, 2.4 |
| 细胞毒性评估 | 化合物浓度（0.1-800 μM）、处理时间（24小时）、检测方法（CCK-8） 阅读提示：Methods 2.6 |
| 假病毒入侵抑制实验 | 细胞密度（5×10⁴/孔）、化合物预孵育浓度（20 μM，及剂量依赖性10、40 μM）、病毒孵育时间（2小时和10小时）、总培养时间（48小时） 阅读提示：Methods 2.7 |
| 自噬检测 | 化合物浓度（10、20、40 μM）、处理时间（24小时）、检测指标（LC3-II/LC3-I） 阅读提示：Methods 2.9, 2.10 |
| SPR结合实验 | ACE2蛋白浓度（30 μg/ml）、黄芩素A浓度（10、20、40、80 μM）、结合和解离时间（各250秒）、流速（20 μl/s） 阅读提示：Methods 2.12 |