识别NLRP3相互作用蛋白
寻找NLRP3的潜在相互作用蛋白，以发现调控NLRP3的新因子。
用抗NLRP3抗体免疫沉淀LPS刺激的小鼠腹腔巨噬细胞裂解液，通过质谱鉴定潜在相互作用蛋白，发现TRIM28。
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TRIM28 SUMO化修饰并稳定NLRP3以促进炎症小体活化
TRIM28 SUMOylates and stabilizes NLRP3 to facilitate inflammasome activation.
实验完整度
高包含体外细胞实验（HEK293T、巨噬细胞）、体内实验（Trim28CKO小鼠LPS刺激）以及机制验证（SUMO化、泛素化、降解实验），多层级功能验证。
主要模型
小鼠原代腹腔巨噬细胞 HEK293T细胞 Trim28CKO小鼠
重点核对
LPS刺激浓度：200 ng/ml（PMs），1 μg/ml（MEFs） ATP刺激浓度：2.5 mM MG132处理浓度：10 μM Trim28CKO小鼠（骨髓细胞特异性敲除） IL-1β分泌检测（ELISA）
摘要
细胞NLRP3蛋白水平对于NLRP3炎症小体的组装和活化至关重要。多种翻译后修饰，包括磷酸化和泛素化，控制NLRP3蛋白降解和炎症小体活化；然而，小泛素样修饰物修饰在控制NLRP3稳定性及后续炎症小体活化中的功能尚不清楚。在这里，我们展示E3 SUMO连接酶三基序蛋白28是NLRP3炎症小体活化的增强子，通过促进NLRP3表达。TRIM28结合NLRP3，促进NLRP3的SUMO1、SUMO2和SUMO3修饰，从而抑制NLRP3泛素化和蛋白酶体降解。一致地，Trim28缺陷在体外和体内均减弱NLRP3炎症小体活化。这些数据确定了SUMO化控制细胞NLRP3水平和炎症小体活化的机制，并揭示了炎症小体活化过程中NLRP3 SUMO化和泛素化的相关性和相互作用。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- TRIM28是否通过SUMO化修饰NLRP3来调控其稳定性，进而影响NLRP3炎症小体活化？
- 核心机制
- TRIM28与NLRP3结合，促进NLRP3的SUMO1和SUMO2/3修饰，抑制其K48连接的多聚泛素化和蛋白酶体降解，从而稳定NLRP3蛋白，增强NLRP3炎症小体活化。
- 主要证据
- 在HEK293T细胞中TRIM28促进NLRP3 SUMO化并抑制其降解；在Trim28缺陷巨噬细胞中，NLRP3 SUMO化降低、泛素化增加、降解加快，且NLRP3炎症小体活化减弱；体内实验中Trim28CKO小鼠LPS刺激后血清IL-1β水平降低。
- 研究意义
- 揭示了SUMO化调控NLRP3水平和炎症小体活化的新机制，TRIM28可能成为治疗NLRP3异常活化相关疾病的靶点。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
验证TRIM28与NLRP3的相互作用
验证TRIM28与NLRP3是否在生理条件下相互作用。
通过共聚焦显微镜观察共定位，免疫共沉淀检测内源性及外源性相互作用。
检测TRIM28对NLRP3炎症小体启动的影响
探究TRIM28是否影响NLRP3炎症小体的启动（priming）过程。
在Trim28CKO巨噬细胞和siRNA敲低细胞中检测LPS诱导的NF-κB激活及炎症因子转录。
检测TRIM28对NLRP3炎症小体活化的影响
明确TRIM28对NLRP3炎症小体活化的功能影响。
在WT和Trim28CKO巨噬细胞中，LPS启动后给予ATP、nigericin或poly(dA:dT)刺激，检测IL-1β分泌、caspase-1和GSDMD切割；体内LPS刺激检测血清细胞因子。
验证TRIM28对NLRP3蛋白稳定性的影响
确定TRIM28是否通过影响NLRP3蛋白降解来调控其表达。
检测TRIM28过表达或缺失对NLRP3蛋白水平的影响，并通过CHX追踪实验和蛋白酶体/溶酶体抑制剂处理分析降解途径。
研究TRIM28对NLRP3泛素化的影响
探究TRIM28是否通过抑制NLRP3泛素化来影响其降解。
在TRIM28缺失或过表达条件下，检测NLRP3的总泛素化及K48、K63连接泛素化水平，并验证TRIM28点突变体（C651A）的影响。
验证TRIM28对NLRP3 SUMO化的影响
确定TRIM28是否作为E3 SUMO连接酶促进NLRP3 SUMO化。
在TRIM28缺失或过表达细胞中检测NLRP3的SUMO1和SUMO2/3修饰水平，使用SUMO化抑制剂2-D08和TRIM28突变体验证。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 细胞培养 | DMEM培养基 | Invitrogen-Gibco | -- |
| 胎牛血清 | Invitrogen-Gibco | -- | |
| 药物处理 | 脂多糖 | Sigma-Aldrich | L4130 |
| 三磷酸腺苷 | Sigma-Aldrich | A1852 | |
| 尼日利亚霉素 | Sigma-Aldrich | N7143 | |
| MG132 | Sigma-Aldrich | C2211 | |
| 磷酸氯喹 | Selleck | S4157 | |
| 3-甲基腺嘌呤 | Selleck | 5142-23-4 | |
| 2-D08 | Selleck | S8696 | |
| poly(dA:dT) | Invivogen | tlrl-patn | |
| 免疫印迹 | 抗Myc抗体 | Sigma-Aldrich | M4439 |
| 抗HA抗体 | Sigma-Aldrich | H3663 | |
| 抗Flag M2抗体 | Sigma-Aldrich | F1804 | |
| 抗磷酸化IκBα抗体 | Cell Signaling Technology | 2859P | |
| 抗IκBα抗体 | Cell Signaling Technology | 4814 | |
| 抗IL-1β抗体 | Cell Signaling Technology | 12242S | |
| 抗AIM2抗体 | Cell Signaling Technology | 13095 | |
| 抗SUMO1抗体 | Cell Signaling Technology | 4930T | |
| 抗SUMO-2/3抗体 | Cell Signaling Technology | 4971T | |
| 抗caspase-1 p20抗体 | AdipoGen | AG-20B-0042 | |
| 抗NLRP3抗体 | AdipoGen | AG-20B-0014 | |
| 抗ASC抗体 | AdipoGen | AG-25B-0006 | |
| 抗caspase-1抗体 | GenTex | GTX14367 | |
| 抗泛素抗体 | Santa Cruz Biotechnology | sc-8017 | |
| 抗TRIM28抗体 | Abcam | ab22553 | |
| 抗GSDMD抗体 | Abcam | ab209845 | |
| 抗NLRP3抗体 | Proteintech | 19771-1-AP | |
| 抗His抗体 | Proteintech | 66005-1-Ig | |
| 辣根过氧化物酶标记的Affinipure山羊抗兔IgG (H+L) | Proteintech | SA00001-2 | |
| 抗β-actin抗体 | Proteintech | 66009-1-Ig | |
| 免疫荧光 | Alexa Fluor 633 | Thermo Fisher Scientific | A-21071 |
| Alexa Fluor 488 | Thermo Fisher Scientific | A-11059 | |
| 转染 | Lipofectamine 2000转染试剂 | Invitrogen | -- |
| INTERFERin转染试剂 | Polyplus-transfection | -- | |
| ELISA | 小鼠IL-1β ELISA试剂盒 | Dakewe Biotech Company Ltd. | 1210123 |
| 小鼠TNF ELISA试剂盒 | Dakewe Biotech Company Ltd. | 1217202 | |
| 小鼠IL-6 ELISA试剂盒 | Dakewe Biotech Company Ltd. | 1210603 | |
| RNA提取 | RNAfast200 RNA提取试剂盒 | -- | -- |
| RT-qPCR | SYBR RT-PCR试剂盒 | Roche | -- |
| Applied Biosystems StepOnePlus实时荧光定量PCR系统 | Applied Biosystems | -- | |
| 免疫沉淀 | protein G Plus-琼脂糖 | Santa Cruz Biotechnology | sc-2002 |
| NP-40 | -- | -- | |
| 蛋白酶抑制剂混合物 | Sigma | -- | |
| BCA蛋白定量试剂 | Pierce | -- | |
| 免疫印迹 | RIPA裂解液 | Pierce | -- |
| Amicon Ultra 10K超滤管 | Millipore | -- | |
| 质粒构建 | KOD-Plus-突变试剂盒 | Toyobo | -- |
| TRIM28表达质粒 | Origene | SC321588 | |
| HA-SUMO1质粒 | Sino Biological | HG13095-NY | |
| HA-SUMO2质粒 | Sino Biological | HG13443-NY | |
| HA-SUMO3质粒 | Sino Biological | HG12782-NY | |
| His-UBC9质粒 | Sino Biological | HG143205-NH | |
| 免疫荧光 | 免疫染色固定液 | Beyotime | -- |
| 免疫染色封闭液 | Beyotime | -- | |
| 免疫染色一抗稀释液 | Beyotime | -- | |
| DAPI | Beyotime | -- | |
| 共聚焦显微镜 | Zeiss LSM780共聚焦激光显微镜 | Zeiss | -- |
| 统计分析 | GraphPad Prism 6.0 | -- | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 细胞培养 | 小鼠原代腹腔巨噬细胞的获取方法：3%巯基乙酸盐肉汤腹腔注射后3天收获细胞；HEK293T细胞培养条件：DMEM+10%FCS，37°C，5% CO2。 阅读提示：Methods 细胞培养部分 |
| 质粒转染 | 转染试剂：Lipofectamine 2000用于HEK293T，INTERFERin用于巨噬细胞；转染时间：48小时。 阅读提示：Methods 质粒构建和转染、RNA干扰检测 |
| 炎症小体活化 | LPS浓度200 ng/ml（PMs），刺激时长7小时，ATP2.5 mM或nigericin 50 mM（原文可能笔误，但按原文）刺激1小时，poly(dA:dT) 200 ng/ml转染。 阅读提示：Methods 细胞培养部分、Figure 3 |
| 蛋白降解分析 | CHX浓度用于追踪实验，文中未明确说明；MG132浓度10 μM，处理时长4小时；氯喹浓度50 μM，3-MA浓度10 mM。 阅读提示：Methods 细胞培养、Figure 4 |
| SUMO化检测 | NEM浓度20 μM，SDS裂解缓冲液组成，加热100°C 10分钟。 阅读提示：Methods SUMO化实验 |
| 体内实验 | LPS剂量25 mg/kg腹腔注射，4-6小时后采血，小鼠月龄6-8周，雌性。 阅读提示：Methods 体内LPS攻击 |