样本收集与准备
获取患者和对照血清样本，用于后续SPRi检测
收集70份来自53例确诊CoViD-19患者的残余血清样本，以及49份对照样本（包括37份健康孕妇和12份非COVID住院患者），将全血凝固后离心分离血清，储存于-20°C，随后稀释至1:100备用。
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基于表面等离子体共振成像的临床检测方法用于检测CoViD-19感染期间IgM、IgG和IgA抗体对SARS-CoV-2的存在及结合强度
High throughput surface plasmon resonance imaging method for clinical detection of presence and strength of binding of IgM, IgG and IgA antibodies against SARS-CoV-2 during CoViD-19 infection.
实验完整度
高包含患者血清样本检测、ELISA/ECLIA对比、SPRi高吞吐量传感器制备及IgM/IgG/IgA检测，并验证了KD与kd的相关性，且进行了功能验证。
主要模型
CoViD-19患者血清样本 非SARS-CoV-2对照血清样本 RBD偶联的HC30M传感器表面
重点核对
血清样本的稀释比例（1:100） RBD蛋白的固定浓度和缓冲液组成 检测抗体（抗IgM、抗IgG、抗IgA）的稀释倍数和注射顺序 解离阶段注入RBD蛋白的浓度（15 µg/ml） ELISA和ECLIA检测方法的对比
摘要
采用表面等离子体共振成像（SPRi）方法测定了102例CoViD-19和非CoViD-19患者血清中针对SARS-CoV-2受体结合域（RBD）的IgG、IgM和IgA抗体的存在及结合强度。SPRi检测可在一次运行中同时测量抗体亚型水平和最终384份患者样本与RBD的结合强度。结果表明，在疾病进程中，IgG水平和结合强度增加，而IgM和IgA水平通常降低。康复患者均表现出高强度的IgG型抗体与RBD蛋白的结合。抗RBD免疫球蛋白SPRi检测为CoViD-19康复患者的免疫状态提供了额外的见解。这种新的高通量方法可应用于评估健康个体在疫苗接种计划中对SARS-CoV-2及其突变体的免疫反应质量。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- 如何利用高通量表面等离子体共振成像技术同时检测CoViD-19患者血清中抗SARS-CoV-2 RBD的IgM、IgG和IgA抗体的存在及结合强度，并评估其与疾病进程的关系？
- 核心机制
- 在疾病过程中，IgG抗体水平和结合强度增加，而IgM和IgA水平下降，康复患者表现出高强度的IgG结合，这可能反映抗体亲和力成熟效应。
- 主要证据
- 对102例患者血清样本进行SPRi检测，同时测量抗体亚型水平和结合强度，并利用反IgM、IgG、IgA抗体进行亚型区分，发现疾病严重程度与总抗RBD抗体浓度相关。
- 研究意义
- 该高通量SPRi方法可用于评估个体对SARS-CoV-2及其突变体的免疫反应质量，并应用于疫苗接种计划的免疫效果监测。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
传感器制备
制备固定有SARS-CoV-2 RBD蛋白的传感器表面，用于捕获血清中的抗RBD抗体
使用HC30M传感器芯片，通过EDC-NHS化学偶联将RBD蛋白固定于表面，然后用乙醇胺封闭，并用含BSA、Casein和Tween 20的缓冲液平衡。
血清样本点样
将患者血清点样到传感器表面，以便检测抗RBD抗体
使用自动点样系统将稀释后的血清样本点样到RBD偶联的传感器芯片上，利用连续流动微点样（CFM）系统或Carterra LSA平台进行点样。
抗体亚型检测
检测血清中IgM、IgG和IgA抗体的水平
在点样后，依次注入抗IgM、抗IgG和抗IgA抗体，通过SPRi实时监测结合信号，并使用双相拟合算法计算Rmax值，代表各亚型抗体的浓度。
结合强度（解离速率）测量
评估抗体与RBD结合的强度，即解离速率（kd）
在点样后，注入游离RBD蛋白（15 µg/ml）以促进解离，监测解离过程，计算表观解离速率常数（kd）用于亲和力排序。
经典SPR验证
验证高通量解离速率与经典SPR测量的亲和力常数（KD）之间的关系
低吞吐量经典SPR实验中，将患者血清以3个稀释度依次注射到固定有RBD的传感器表面，用1:1拟合算法计算KD，并与从高通量方法中获得的kd进行对比。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 传感器制备 | HC30M传感器芯片 | Xantec Bioanalytics | C19RBDHC30M |
| SARS-CoV-2 Spike RBD蛋白 | SINO Biological | 40592-V08H | |
| N-羟基琥珀酰亚胺 | -- | -- | |
| N-乙基-N'-(3-二甲氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐 | -- | -- | |
| 缓冲液 | 磷酸盐缓冲液 | -- | -- |
| 牛血清白蛋白 | -- | -- | |
| 酪蛋白 | -- | -- | |
| 吐温20 | -- | -- | |
| 点样 | 连续流动微点样系统 | Wasatch Microfluidics | -- |
| Thunderbolt ELISA机器人 | Gold standard diagnostics | -- | |
| SPR测量 | IBIS MX96 | IBIS Technologies | -- |
| Carterra LSA平台 | Carterra | -- | |
| 抗体检测 | 山羊抗人IgM抗体 | Fitzgerald | 20-S5170 |
| 山羊抗人IgG抗体 | Fitzgerald | 20-S1211G001-S4 | |
| 山羊抗人IgA抗体 | Fitzgerald | 20-S1111G000-S4 | |
| 对照组检测 | Euroimmun抗SARS-CoV-2 ELISA IgG检测试剂盒 | Euroimmun | -- |
| 抗SARS-CoV-2 Ig电化学发光检测 | Roche Diagnostics | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 样本收集与处理 | 患者样本的采集时间（发病后天数）、样本量（70例患者，53名患者）、血清分离条件 阅读提示：Material and methods 部分 'Patient and control serum samples' |
| 传感器制备 | RBD蛋白浓度、固定缓冲液pH、EDC/NHS浓度及处理时间、封闭剂浓度 阅读提示：Material and methods 部分 'Sensor preparation' |
| 点样 | 点样系统、样本稀释比例（1:100）、点样时间（15分钟） 阅读提示：Material and methods 部分 'Spotting sera' |
| 抗体检测 | 抗IgM/IgG/IgA抗体的稀释倍数、注射顺序（MGA）、注射时间 阅读提示：Material and methods 部分 'Measurements on the IBIS MX96' |
| 解离速率测量 | RBD注射浓度（15 µg/ml）、解离时间（5分钟）、数据计算方式 阅读提示：Material and methods 部分 'Off-rate measurements on the LSA' |