免疫及噬菌体文库构建
获得针对靶抗原的免疫噬菌体展示文库
采用基因枪免疫Wistar大鼠，提取脾脏RNA逆转录构建scFv噬菌体文库，库容分别为CD160 1×10^6和CD123 1×10^8。
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结合噬菌体展示与SMRTbell下一代测序快速发现功能性scFv片段
Combining phage display with SMRTbell next-generation sequencing for the rapid discovery of functional scFv fragments.
实验完整度
高包含体外噬菌体淘选、SMRT测序、流式细胞术、SPR亲和力、热稳定性及表位分箱等多层验证，并涉及两个独立文库。
主要模型
CD160大鼠免疫噬菌体展示文库 CD123大鼠免疫噬菌体展示文库 表达CD160或CD123的SupT1细胞
重点核对
淘选轮次（3轮） NGS测序平台（PacBio RS2） 流式细胞术验证抗原结合 SPR测定的亲和力范围 热稳定性(Tm)范围
摘要
噬菌体展示技术与下一代测序（NGS）相结合目前是从多样性文库中富集和分离单克隆抗体的最先进方法。然而，目前用于噬菌体展示文库测序的NGS方法受到第二代测序平台短连续读长限制。因此，抗体序列的鉴定通常局限于单个抗体结构域或单域结合部分如骆驼科VHH或软骨鱼IgNAR抗体的分析。在本研究中，我们报告了应用第三代测序来解决这一限制。我们使用单分子实时（SMRT）测序结合发夹适配环连接来促进全长单链Fv（scFv）文库的准确检测。我们的方法有助于在淘选后数天内快速分离和测试从噬菌体展示文库富集的scFv抗体。针对CD160和CD123的两个文库进行了淘选并通过NGS监测。NGS抗体数据集的分析导致分离出几个功能性scFv抗体，这些抗体未通过传统淘选和筛选策略鉴定。我们的方法将免疫文库的噬菌体展示选择与scFv片段的全长检测相结合，是一种发现具有一系列亲和力和生物物理特性的功能性抗体的简便方法。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- 如何通过结合噬菌体展示与SMRT长读长测序，快速发现功能性全长scFv抗体？
- 核心机制
- SMRT测序结合发夹适配连接实现全长scFv的环形一致性测序，保留VH-VL配对信息，从而无需传统筛选即可鉴定功能性抗体。
- 主要证据
- 对CD160和CD123免疫文库进行3轮淘选，PacBio测序分析揭示克隆富集和配对，筛选出多个结合抗体，经SPR和流式验证。
- 研究意义
- 该方法简单、低成本，可快速发现多样性抗体，弥补传统方法对稀有克隆的遗漏，具有广泛适用性。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
噬菌体淘选
富集针对靶抗原的特异性噬菌体
利用Strep-Tactin磁珠进行3轮淘选，从文库中富集特异性结合子。
SMRT测序文库制备与测序
获取全长scFv序列并分析文库多样性
扩增噬菌粒DNA，制备SMRTbell文库，PacBio RS2测序。
NGS数据分析与克隆选择
基于序列丰度和配对信息选择候选克隆
使用IMGT/HighV-QUEST或自定义流程分析，筛选HCDR3频率高的克隆并配对轻链。
抗体表达与功能验证
验证候选scFv的结合活性和生物物理性质
合成scFv基因，克隆至AbVec2.0载体，瞬时表达scFv-Fc融合蛋白，进行流式细胞术、SPR、热稳定性和表位分箱实验。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 噬菌体文库构建 | pHEN1载体 | -- | -- |
| 免疫 | 基因枪 | Biorad | -- |
| RNA提取 | RNAeasy™ | QIAGEN | -- |
| 噬菌体淘选 | Strep-Tactin® | IBA | -- |
| 测序文库构建 | DNA模板制备试剂盒1.0 | Pacific Biosciences | 100-259-100 |
| P6 DNA/聚合酶结合试剂盒2.0 | Pacific Biosciences | 100-236-500 | |
| 测序 | SMRT细胞v3.0 | Pacific Biosciences | 100-171-800 |
| PacBio RS2测序仪 | Pacific Biosciences | -- | |
| DNA定量 | Qubit荧光计 | Life Technologies | 32850 |
| DNA片段分析 | Bioanalyzer 2100 | Agilent Technologies | 5067-1508 |
| SPR | Biacore T200 | GE Healthcare | -- |
| CM5传感芯片 | GE Healthcare | 29149603 | |
| HBS-P+缓冲液 | GE Healthcare | BR100671 | |
| 抗小鼠IgG抗体 | GE Healthcare | BR100838 | |
| 热稳定性分析 | Prometheus NT.48 | NanoTemper | -- |
| 交叉反应ELISA | 人胰岛素 | Sigma | I9278-5ML |
| 双链DNA | Sigma | D4522-1MG | |
| 单链DNA | Sigma | D8899-1MG | |
| 心磷脂 | Sigma | C0563-10MG | |
| 脂多糖 | Invivogen | tlrl-eblps | |
| 钥孔血蓝蛋白 | Sigma | H8283-50MG | |
| Nunc MaxiSorp板 | Nunc | -- | |
| 1-Step Ultra TMB底物 | ThermoFisher Scientific | 34028 | |
| Multiskan酶标仪 | ThermoFisher Scientific | -- | |
| 流式细胞术 | 抗小鼠二抗 | Jackson ImmunoResearch | 115-116-146 |
| MACSQuant分析仪 | Miltenyi Biotec | -- | |
| 表位分箱 | NiNTA Series S芯片 | GE Healthcare | -- |
| 重组His标签CD160蛋白 | Sino Biological | 12191-H08H | |
| 抗体构建 | gBlocks基因片段 | Integrated DNA Technologies | -- |
| AbVec2.0载体 | -- | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 噬菌体文库构建与淘选 | 免疫动物（Wistar大鼠，3只），基因枪免疫，文库大小，淘选轮次（3轮），磁珠类型（Strep-Tactin） 阅读提示：Materials and methods: Library construction and bio-panning |
| SMRT测序 | PCR循环数（20），测序平台（PacBio RS2），读长筛选（900-1200 bp），SMRTbell制备试剂盒 阅读提示：Materials and methods: PacBio SMRTbell™ library assembly |
| NGS数据分析 | 分析工具（IMGT/HighV-QUEST、IgBlastn、Change-O），克隆选择标准（HCDR3频率，距离） 阅读提示：Materials and methods: NGS analysis, ranking and clone selection |
| 抗体表达 | 表达载体（AbVec2.0），细胞系（未明确），表达时间（未明确） 阅读提示：Materials and methods: Generation of scFv constructs |
| 功能验证 | 流式细胞术细胞系（SupT1），SPR设备（Biacore T200），DSF设备（Prometheus NT.48） 阅读提示：Materials and methods: Surface plasmon resonance, Differential scanning fluorimetry, Flow cytometry |