Apatinib inhibits the growth of small cell lung cancer via a mechanism mediated by VEGF, PI3K/Akt and Ki-67/CD31.
包含体外细胞增殖实验、体内异种移植瘤模型，以及免疫组化、免疫荧光和HE染色等验证，但机制验证主要依赖表达检测，缺乏Western blot对磷酸化蛋白的验证。
NCI-H345细胞 小鼠异种移植瘤模型
NCI-H345细胞高表达VEGF、VEGFR2和pVEGFR2 rhVEGF处理浓度30 ng/ml，时间60 min 阿帕替尼处理浓度250 nM，时间60 min 体内给药剂量50 mg/kg，每日灌胃 小鼠模型：8只雄性裸鼠，4周龄，体重16-20g
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
选择高表达VEGF、VEGFR2和pVEGFR2的细胞系，并确定rhVEGF最佳处理时间。
通过Western blot检测NCI-H345和NCI-H446细胞中VEGF、VEGFR2和pVEGFR2表达水平，选择NCI-H345细胞。随后用30 ng/ml rhVEGF处理NCI-H345细胞0、30、60、120分钟，Western blot检测VEGFR2和pVEGFR2表达，确定60分钟为最佳时间。
评估阿帕替尼对NCI-H345细胞增殖的影响，并确定最佳处理浓度和时间。
用不同浓度阿帕替尼（50、100、150、200、250 nM）处理NCI-H345细胞24、48、72小时，CCK-8检测细胞活力。随后用250 nM阿帕替尼处理60分钟，分为八组，比较不同处理组合的细胞增殖。
评估阿帕替尼在体内对肿瘤生长的影响。
将NCI-H345细胞皮下注射至裸鼠右侧腋窝，建立异种移植瘤模型。随机分两组，阿帕替尼组每日灌胃50 mg/kg，对照组给予等体积生理盐水。测量肿瘤大小，第37天处死，取肿瘤组织。
检测阿帕替尼对肿瘤组织中VEGF、pVEGFR2、PI3K/Akt通路及增殖、血管生成相关蛋白表达的影响。
对肿瘤组织进行免疫组化染色检测VEGF、pVEGFR2、PI3K、p-PI3K、AKT、p-AKT、ERK1/2、p-ERK1/2和Ki-67；免疫荧光检测CD31表达。
评估阿帕替尼对肿瘤组织坏死的影响。
对肿瘤组织进行HE染色，观察坏死区域。
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 细胞培养 | RPMI-1640培养基 | KeyGen Biotech | -- |
| 胎牛血清 | Thermo Fisher Scientific | -- | |
| 药物处理 | 二甲基亚砜 | -- | -- |
| 重组人VEGF | Sino Biological | 10542-H08H | |
| Western blot | RIPA裂解液 | Beyotime | -- |
| PVDF膜 | EMD Millipore | -- | |
| 牛血清白蛋白 | Beyotime | -- | |
| 抗VEGF抗体 | Abcam | ab32151 | |
| 抗VEGFR2抗体 | Abcam | ab11939 | |
| 抗pVEGFR2抗体 | Bioss | bs-2674R | |
| 抗GAPDH抗体 | ZSGB-Bio | TA-08 | |
| 过氧化物酶标记二抗 | ZSGB-Bio | ZB-2305, ZB-2301 | |
| SuperSignal West Pico化学发光底物 | Thermo Fisher Scientific | -- | |
| ChemiDoc XRS+凝胶成像系统 | Bio-Rad Laboratories | -- | |
| Quantity One软件 | Bio-Rad Laboratories | -- | |
| 细胞增殖检测 | CCK-8试剂盒 | -- | -- |
| 酶标仪 | Rayto | RT-6100 | |
| 免疫组化 | 抗PI3K抗体 | ABclonal Technology | AF5315 |
| 抗p-PI3K抗体 | ABclonal Technology | AP0854 | |
| 抗AKT抗体 | Abcam | ab8805 | |
| 抗p-AKT抗体 | Bioss | bs-2720R | |
| 抗ERK1/2抗体 | Cell Signaling | 4370 | |
| 抗p-ERK1/2抗体 | Bioss | bs-3016R | |
| 抗Ki-67抗体 | KeyGen Biotech | KG22487-4 | |
| 免疫荧光 | 抗CD31抗体 | Abcam | ab32457 |
| Alexa Fluor 647偶联的山羊抗兔IgG | Beyotime | A0468 | |
| DAPI | -- | -- | |
| Triton X-100 | -- | -- | |
| 免疫组化和免疫荧光 | ImageJ软件 | National Institutes of Health | -- |
| 光学显微镜 | Olympus | CX41, CKX53 | |
| 动物实验 | 水合氯醛 | -- | -- |
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 细胞筛选与处理 | NCI-H345细胞高表达VEGF、VEGFR2和pVEGFR2；rhVEGF处理浓度30 ng/ml，时间60 min 阅读提示：Materials and Methods: 2.2 Cell screening and rhVEGF treatment; Results: 3.1 |
| 体外增殖实验 | 阿帕替尼浓度250 nM，处理时间60 min；细胞密度10,000 cells/well；CCK-8孵育2小时 阅读提示：Materials and Methods: 2.4 Cell proliferation in vitro; Results: 3.2 |
| 体内动物模型 | 小鼠数量8只，雄性，4周龄，体重16-20g；细胞注射量1×10^7 cells；给药剂量50 mg/kg，每日灌胃；实验周期37天 阅读提示：Materials and Methods: 2.1 and 2.5; Results: 3.3 |
| 组织蛋白表达检测 | 一抗稀释比例：VEGF 1:1000, pVEGFR2 1:1000, PI3K 1:1000, p-PI3K 1:1000, AKT 1:1000, p-AKT 1:1000, ERK1/2 1:1000, p-ERK1/2 1:1000, Ki-67 1:1000, CD31 1:200；二抗1:2500 阅读提示：Materials and Methods: 2.6 Immunohistochemical analysis, 2.7 Immunofluorescence analysis; Results: 3.4 and 3.5 |
| 组织坏死评估 | HE染色步骤 阅读提示：Materials and Methods: 2.8 Hematoxylin and eosin staining; Results: 3.6 |
