分子构建与表达
设计并合成编码VHH2-Fc-VHH2的cDNA，并在CHO-GS细胞中瞬时表达。
通过PCR扩增合成的cDNA，克隆到pXC 17-4载体，转染CHO-GS细胞，培养后收集上清。
关于丁香通
公司信息
个人用户
企业机构
无忧采购 轻松科研
- 移动端
一种携带四个纳米抗体的Fc二聚体的生物化学、结构及细胞内吞作用
Biochemistry, structure, and cellular internalization of a four nanobody-bearing Fc dimer.
实验完整度
高包含分子构建、生物物理表征（SEC-MALS、LC-MS、SPR）、结构解析（电镜与建模）及细胞功能验证（内吞动力学），多层次证据支持。
主要模型
CHO-GS细胞（蛋白表达） SKBR3细胞（HER2高表达，内吞实验） MDA-MB231细胞（HER2弱表达，阴性对照）
重点核对
VHH2-Fc-VHH2的构建序列和分子量（理论105,274.46 Da） 与HER2的结合亲和力（KD约4.39 nM） 1:4复合物的形成及分子量（384,748 Da） 细胞系HER2表达水平（SKBR3高表达，MDA-MB231弱表达） 内吞实验中抗体浓度（70 nM）和孵育时间（0-24小时）
摘要
VHH代表骆驼科IgG重链抗体的可变区。VHH家族构成了一组来源于抗体的有趣蛋白质，尽管其分子量相对较小（约12,000 Da），但保持了识别抗原的能力。在我们继续探索这些分子可能性的过程中，我们选择设计具有保持抗原识别但增强能力的替代分子，通过将四个VHH与一个Fc（抗体的可结晶片段）融合。这样做的目的是获得具有更好定量抗原识别能力（×4）且尺寸保持在110 kDa以下的分子。本文中，我们描述了这些我们称之为VHH2-Fc-VHH2的分子的构建。通过电子显微镜和建模确定了VHH2-Fc-VHH2与HER2抗原复合物的结构。该分子显示在其柔性的臂末端结合四个HER2蛋白。VHH2-Fc-VHH2还显示出通过HER2受体的内吞能力优于参考抗HER2单克隆抗体赫赛汀®，以及简单融合两个VHH与一个Fc（VHH2-Fc）的分子。这种新型分子VHH2-Fc-VHH2可能成为治疗武器库中有趣的补充，具有从诊断到治疗的多种应用。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- 构建一种融合四个抗HER2 VHH和一个Fc的四价分子VHH2-Fc-VHH2，并评估其结构、抗原结合能力及细胞摄取能力。
- 核心机制
- VHH2-Fc-VHH2通过其四个VHH臂与HER2结合，并通过HER2受体介导的内吞作用进入细胞。
- 主要证据
- SEC-MALS和SPR确认分子量为106,080 Da且KD为4.39 nM；电镜和建模显示复合物含有四个HER2；细胞实验证明内吞能力优于赫赛汀和VHH2-Fc。
- 研究意义
- VHH2-Fc-VHH2可能作为多价抗体样分子，用于诊断和治疗，特别是通过靶向递送细胞毒性化合物。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
蛋白纯化与表征
通过Protein A亲和层析纯化VHH2-Fc-VHH2，并验证其纯度、分子量和稳定性。
利用Protein A柱纯化，SDS-PAGE分析纯度，SEC-MALS测定分子量，LC-MS分析糖基化。
结合亲和力测定
测定VHH2-Fc-VHH2与HER2的结合动力学参数。
使用SPR生物传感器，将VHH2-Fc-VHH2固定在CM4芯片，注射不同浓度HER2，拟合动力学数据。
复合物形成与结构分析
形成VHH2-Fc-VHH2与HER2的1:4复合物，并通过电镜和建模确定其结构。
将VHH2-Fc-VHH2与HER2按1:4比例孵育，纯化复合物，进行负染电镜观察，并通过2D分类和3D建模分析。
细胞识别与内吞动力学
评估VHH2-Fc-VHH2在HER2阳性细胞表面的特异性识别及内吞能力，并与赫赛汀等对照比较。
将SKBR3和MDA-MB231细胞与各抗体孵育，通过免疫荧光标记，定量分析膜和细胞质荧光强度随时间变化。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
验证分子结合功能
数据分析与统计
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 分子克隆 | Q5高保真DNA聚合酶 | New England Biolabs | M0491L |
| pXC 17-4载体 | Lonza | -- | |
| 蛋白纯化 | Hitrap蛋白A高性能柱 | GE Healthcare | GE17-0403-03 |
| 蛋白表征 | Superdex 200 increase 5/150 GL | GE Healthcare | -- |
| Superose 6 10/300 GL | GE Healthcare | -- | |
| Dawn8+ HELEOS II | Wyatt Technology | -- | |
| Optilab T-rex | Wyatt Technology | -- | |
| 质谱分析 | Acquity UPLC H-Class Bio系统 | Waters | -- |
| Xevo G2-XS Q-TOF质谱仪 | Waters | -- | |
| SPR | Biacore T200 | GE Healthcare | -- |
| CM4芯片 | Biacore | -- | |
| 细胞实验 | McCoy培养基 | 文中未明确说明 | -- |
| RPMI 1640-glutamax培养基 | 文中未明确说明 | -- | |
| 胎牛血清 | 文中未明确说明 | -- | |
| 青霉素/链霉素 | 文中未明确说明 | -- | |
| HEPES | 文中未明确说明 | -- | |
| 牛血清白蛋白 | 文中未明确说明 | -- | |
| Triton X-100 | 文中未明确说明 | -- | |
| F(ab')2-山羊抗人IgG Fc二抗，偶联Alexa Fluor 488 | Thermofischer | H10120 | |
| 6x-His标签抗体，Alexa Fluor 488偶联物（His.H8） | Thermofischer | MA1-21315-D488 | |
| CellMask Red细胞膜染料 | 文中未明确说明 | -- | |
| DAPI | 文中未明确说明 | -- | |
| PerkinElmer Opera Phenix高内涵筛选系统 | PerkinElmer | -- | |
| 赫赛汀（曲妥珠单抗） | Roche | -- | |
| IgG1同型对照 | Invitrogen | 12000C | |
| 电镜 | JEOL 2100 LaB6 | JEOL | -- |
| 2K Gatan CCD相机 | Gatan | -- | |
| 数据处理 | Harmony软件 | PerkinElmer | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 分子构建与表达 | 质粒构建使用的载体（pXC 17-4）和限制酶；转染方法（电穿孔）；CHO-GS细胞密度（3E6 cells/ml）；培养条件（37°C, 5% CO2, 200 rpm, 1周） 阅读提示：见Methods部分“Production of the tetravalent VHH2-Fc-VHH2” |
| 蛋白纯化 | Protein A柱型号（Hitrap）；洗脱pH（3）和缓冲液（0.1 M柠檬酸钠）；上样缓冲液（0.1 M磷酸盐，150 mM NaCl）；流速（5 ml/min） 阅读提示：见Methods部分“Production of the tetravalent VHH2-Fc-VHH2” |
| 结合亲和力测定 | SPR芯片类型（CM4）；固定化蛋白浓度（2.5 μg/ml）和水平（600 RU）；HER2浓度范围（0.09-50 nM）；运行缓冲液成分（Tris-HCl, NaCl, P20）；结合和解离时间（17.5和20分钟） 阅读提示：见Methods部分“SPR experiments” |
| 复合物形成 | VHH2-Fc-VHH2与HER2的浓度（2 μM和8 μM）和孵育时间（1小时） 阅读提示：见Methods部分“Purification of the VHH2-Fc-VHH2 in complex with HER2” |
| 细胞实验 | 细胞系（SKBR3和MDA-MB231）的培养条件；抗体浓度（70 nM）；孵育时间（0-24小时）；标记抗体（Alexa Fluor 488偶联物）；检测设备（Opera Phenix） 阅读提示：见Methods部分“Internalization kinetics in SK-BR-3 cells” |