患者临床特征和标本采集
描述两名患者的临床诊断、治疗和死亡情况，并采集肺和其他器官标本进行病理学分析。
对两名COVID-19死亡患者进行尸检，采集肺组织和心脏、肾脏标本，记录临床和实验室数据。
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肺泡巨噬细胞功能紊乱与细胞因子风暴在两名重症COVID-19患者发病机制中的作用
Alveolar macrophage dysfunction and cytokine storm in the pathogenesis of two severe COVID-19 patients.
实验完整度
中包含尸检病理学检查、HE/AB-PAS/Masson染色、免疫组化、RT-PCR和流式细胞术，但主要基于两名患者尸检样本，缺乏功能验证和机制验证。
主要模型
两名COVID-19死亡患者（尸检肺组织） 正常肺组织细胞悬液（用于流式细胞术） 六名健康供体外周血白细胞（用于流式细胞术）
重点核对
尸检样本：两名COVID-19死亡患者，死亡后6小时和9小时进行尸检，分别采集38和60块肺组织。 免疫组化：使用CD68、CD3、CD4、CD8、CD20、CD56、PD-1、PD-L1、IL-6、IL-10、TNFα、ACE2和Rp3-NP抗体检测组织。 RT-PCR：使用AmoyDx FFPE RNA Kit提取RNA，并使用Liferiver 2019-nCoV检测试剂盒检测SARS-CoV-2 E、N和RdRp基因。 流式细胞术：正常肺组织和健康供体外周血白细胞与S蛋白和ACE2抗体孵育，检测CD3、CD14、CD68标记细胞。
摘要
背景：由SARS-CoV-2感染引起的新型冠状病毒肺炎（COVID-19）可导致一系列临床症状和严重疾病，包括急性呼吸窘迫综合征（ARDS）和致命性器官衰竭。我们报告了对死亡病例肺和其他器官的基础病理学检查，以理解重症COVID-19的机制并发展针对这些病例的特异性治疗。方法：对两名COVID-19死亡患者的尸体进行了尸检和病理学检查。对每例患者进行大体解剖和HE染色的组织学检查。采用阿尔辛蓝/高碘酸-雪夫（AB-PAS）染色和Masson染色检测肺组织中的黏液、纤维蛋白和胶原纤维。对两名患者的肺组织切片进行免疫组织化学染色。采用实时PCR检测SARS-CoV-2感染。采用流式细胞术检测S蛋白与巨噬细胞表面ACE2的直接结合及表达。结果：肺的主要病理特征包括I型肺泡上皮细胞广泛损伤和II型肺泡细胞非典型增生，伴有透明膜形成、局灶性出血、渗出和肺水肿以及肺实变。肺泡内黏液栓伴纤维蛋白样渗出和肺泡巨噬细胞功能障碍是特征性异常。肺泡和肺门淋巴组织中的II型肺泡上皮细胞和巨噬细胞被SARS-CoV-2感染。SARS-CoV-2的S蛋白通过S蛋白-ACE2相互作用直接与巨噬细胞结合。解释：SARS-CoV-2感染肺泡巨噬细胞可能是“细胞因子风暴”的驱动因素，可能导致肺组织和心肺损伤，并导致多器官衰竭。资助：上海广慈转化医学研究发展基金会，中国上海。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- 重症COVID-19患者肺部的关键病理变化及其发病机制是什么？
- 核心机制
- SARS-CoV-2感染肺泡巨噬细胞，通过S蛋白-ACE2相互作用，导致巨噬细胞聚集和激活，释放细胞因子（如IL-6）引起“细胞因子风暴”，导致肺损伤和多器官衰竭。
- 主要证据
- 通过尸检肺组织病理学检查发现肺泡巨噬细胞聚集、PD-L1表达和细胞因子释放，并通过免疫组化和RT-PCR证实巨噬细胞感染SARS-CoV-2，流式细胞术证实S蛋白与巨噬细胞ACE2结合。
- 研究意义
- 这些发现可能为理解COVID-19发病机制和重症患者治疗策略提供依据，支持抗IL-6/IL-6R抗体（如托珠单抗）治疗以阻断细胞因子释放综合征。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
组织病理学染色
观察肺组织的基本病理改变（如渗出、黏液、纤维化等）。
对福尔马林固定、石蜡包埋的肺组织进行HE染色、AB-PAS染色和Masson染色，观察肺泡损伤、渗出、黏液栓、纤维化等。
免疫组化检测细胞表型和感染
检测肺组织和淋巴结中免疫细胞浸润、细胞因子表达以及SARS-CoV-2感染。
使用多种抗体进行免疫组化染色，检测巨噬细胞标志物、淋巴细胞标志物、细胞因子（IL-6、IL-10、TNFα）、ACE2和SARS-CoV-2核蛋白。
RT-PCR检测病毒RNA
证实肺组织和肺门淋巴结中存在SARS-CoV-2RNA。
从石蜡包埋组织中提取总RNA，使用Taqman探针检测SARS-CoV-2的E、N和RdRp基因。
流式细胞术分析S蛋白结合和ACE2表达
验证肺泡巨噬细胞是否是SARS-CoV-2的直接靶细胞。
从正常肺组织和健康供体外周血制备细胞悬液，与纯化的S蛋白或抗ACE2抗体孵育，然后与标记抗体标记进行流式细胞术分析。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 组织病理学染色 | AmoyDx® FFPE RNA试剂盒 | Amoydiagnostics | ADx-FF04 |
| RT-PCR检测 | 2019-nCoV核酸检测试剂盒 | Liferiver | Z-RR-0479-02-25 |
| 免疫组化 | CD68抗体（克隆KP1） | Dako Omnis, Agilent | -- |
| CD3抗体（克隆SP7） | Dako Omnis, Agilent | -- | |
| CD4抗体（克隆4B12） | Dako Omnis, Agilent | -- | |
| CD8抗体（克隆C8/144B） | Dako Omnis, Agilent | -- | |
| CD20抗体（克隆L26） | Dako Omnis, Agilent | -- | |
| CD56抗体（克隆123C3） | Dako Omnis, Agilent | -- | |
| PD-1抗体（克隆UMAB199） | Dako Omnis, Agilent | -- | |
| PD-L1抗体（克隆22C3） | Dako Omnis, Agilent | -- | |
| 抗IL-6抗体 | abcam | -- | |
| 抗IL-10抗体 | abcam | -- | |
| 抗TNFα抗体 | abcam | -- | |
| ACE2抗体（克隆1G4） | ORIGENE | -- | |
| SARS-CoV-2 Rp3-N抗体 | -- | -- | |
| 细胞消化 | IV型胶原酶 | Sigma | C5138 |
| 细胞培养 | DMEM培养基 | Gibico | -- |
| 胎牛血清（FBS） | Gibico | -- | |
| 细胞过滤 | 70 µm细胞过滤器 | BD Falcon | 352350 |
| 红细胞裂解 | 红细胞裂解液 | Yeasen | 40401ES60 |
| 流式细胞术 | Human BD Fc Block™ | BD Biosciences | 564219 |
| SARS-CoV-2（2019-nCoV）刺突蛋白 | Sino Biological | 40591-V02H | |
| 兔抗人ACE2抗体 | Proteintech | 21115-1-AP | |
| Alexa Fluor 546山羊抗兔IgG（H+L）多克隆抗体 | ThermoFisher | -- | |
| APC鼠抗人CD3单克隆抗体（克隆HIT3a） | BD Bioscience | -- | |
| FITC鼠抗人CD14单克隆抗体（克隆RMO52） | Beckman Coulter | -- | |
| PE/Cy7鼠抗人CD68单克隆抗体（克隆Y1/82A） | Biolegend | -- | |
| PE抗人IgG Fc（克隆M1310G05） | Biolegend | -- | |
| BD LSRFortessa™ X-20流式细胞仪 | BD Biosciences | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 尸检和病理组织学 | 患者死亡到尸检时间（6小时和9小时）、肺组织采集数量（38和60块）、组织固定和包埋方法（10%中性福尔马林固定、石蜡包埋）、染色方法（HE、AB-PAS、Masson） 阅读提示：Methods 2.1和2.2 |
| 免疫组化 | 抗体种类、克隆号、稀释度（如CD68 1:100、IL-6 1:250、IL-10 1:300、TNFα 1:80、ACE2 1:160、Rp3-NP 1:100）、孵育条件和显色方法 阅读提示：Methods 2.2 |
| RT-PCR | RNA提取试剂盒、PCR试剂盒、检测基因（E、N、RdRp）、扩增条件和样本类型（肺组织和肺门淋巴结组织） 阅读提示：Methods 2.3 |
| 流式细胞术 | 正常肺组织来源（肺癌手术邻近组织）、消化条件（IV型胶原酶、37°C、25分钟）、红细胞裂解、S蛋白和ACE2抗体的浓度和孵育时间、流式抗体（CD3、CD14、CD68）和仪器设置 阅读提示：Methods 2.4 |