内源mRNA翻译能力筛选
评估内源基因mRNA的翻译效率，以识别高翻译能力的候选UTR。
通过生物信息学分析4248种mRNA的半衰期和翻译速率常数，计算每种mRNA的蛋白质和氨基酸生产能力，优先选择Rps27a基因的UTR进行后续实验。
关于丁香通
公司信息
个人用户
企业机构
无忧采购 轻松科研
- 移动端
利用mRNA序列和纳米颗粒在体内递送SARS-CoV-2抗原
Leveraging mRNA Sequences and Nanoparticles to Deliver SARS-CoV-2 Antigens In Vivo.
实验完整度
高研究包含体外细胞实验（Hep3B、293T）筛选UTR、功能验证（荧光素酶表达）、体内小鼠模型（免疫原性）和机制探讨（UTR结构、microRNA靶点），证据层级多样。
主要模型
Hep3B细胞 293T细胞 C57BL/6小鼠
重点核对
最优UTR组合（NCA-7d 5′ UTR和S27a+R3U 3′ UTR） mRNA合成：含有cap-1结构和120A尾巴，并使用假尿苷完全替代UTP TT3纳米颗粒配方：脂质:DOPE:胆固醇:DMG-PEG2000摩尔比20:30:40:0.75 免疫方案：雌性C57BL/6小鼠，肌肉注射或皮下注射，剂量12、1.2、0.12、0.012μg/只，第0天初次，第14天加强 抗体检测：ELISA检测抗S1抗体，以重组抗刺突蛋白单克隆抗体建立标准曲线
摘要
SARS-CoV-2已在全球范围内成为大流行病；因此，迫切需要有效的疫苗。近来，信使RNA（mRNA）已成为一种有前景的疫苗接种平台。在这项工作中，对mRNA的非翻译区（UTR）进行了系统改造，以增强蛋白质产生。通过内源基因表达的综合分析和从头设计UTR，确定了最优的5′ 和3′ UTR组合，命名为NASAR，其效率比测试的内源UTR高5到10倍。更重要的是，由脂质衍生的TT3纳米颗粒递送的NASAR mRNA触发了潜在的SARS-CoV-2抗原的显著表达。由TT3纳米颗粒和NASAR mRNA诱导的抗原特异性抗体比接种小鼠中FDA批准的脂质纳米颗粒材料MC3诱导的抗体高两个数量级以上。这些NASAR mRNA值得作为替代性SARS-CoV-2疫苗进一步开发。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- 如何通过系统改造mRNA的非翻译区（UTR）增强蛋白质表达，并利用其编码SARS-CoV-2抗原以开发有效的mRNA疫苗？
- 核心机制
- 通过在5′ UTR中去除抑制性TOP基序、优化长度和核苷酸组成，并在3′ UTR中加入HuR结合基序R3U，增强了mRNA的翻译效率，使NASAR UTR比内源UTR(CYBA)高效5-7倍，比起始UTR(S27a-45)高效10倍。
- 主要证据
- 在Hep3B和293T细胞中，NASAR mRNA的荧光素酶表达水平显著高于对照；在小鼠中，经TT3纳米颗粒递送，NASAR mRNA的荧光素酶活性比MC3递送高70倍以上，并诱导了强烈的抗原特异性抗体。
- 研究意义
- 本研究为mRNA UTR的工程化提供了概念验证，所开发的NASAR mRNA可作为SARS-CoV-2疫苗候选物，并可能有利于mRNA疗法的未来临床转化。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
内源5′ UTR的修饰与评估
检验去除5′ UTR中推测的TOP基序对翻译效率的影响。
对Rps27a基因的两种5′ UTR（S27a-44和S27a-45）去除TOP基序，构建表达荧光素酶的mRNA，用Lipofectamine 3000转染Hep3B和293T细胞，检测相对荧光素酶活性。
内源3′ UTR的比较与选择
比较不同来源的3′ UTR对翻译效率的影响。
将S27a 3′ UTR与TF、AAT和HCV的3′ UTR分别构建到同一5′ UTR（S27a-44′）后，检测荧光素酶表达，并验证3′ UTR长度和结构的作用。
从头设计5′ UTR并优化长度和组成
确定最优的5′ UTR长度和核苷酸组成，以最大化翻译效率。
使用AntaRNA设计系列5′ UTR，长度分别为10、30、50、70、90 nt，以及不同核苷酸组成的NCA-1至NCA-8，用RNAfold验证结构，评估荧光素酶表达。
移除microRNA靶位点进一步优化5′ UTR
评估去除5′ UTR中预测的microRNA靶位点对翻译效率的影响。
使用miRDB预测NCA-7和NCA-8中的miRNA靶位点，然后通过打乱核苷酸顺序创建NCA-7d和NCA-8d，并比较其荧光素酶表达。
3′ UTR功能基序的整合
筛选能够增强mRNA翻译的3′ UTR功能基序。
在S27a 3′ UTR下游整合QRE1、QRE2、R3U、ARE、EMCV和FMDV等基序，检测荧光素酶表达，选择R3U为优选基序。
NASAR mRNA编码SARS-CoV-2抗原
验证NASAR UTR能否有效表达SARS-CoV-2潜在抗原。
构建编码S、N、M、E、RBD的NASAR mRNA，转染293T细胞，通过ELISA定量RBD表达，并通过免疫染色检测抗原表达。
体内荧光素酶表达和抗原表达评估
评估NASAR mRNA在体内经由TT3纳米颗粒递送的表达效率，并比较TT3与MC3的递送效果。
将荧光素酶mRNA用TT3或MC3配制，肌肉注射C57BL/6小鼠，检测体内荧光素酶活性；同时将编码RBD和S的mRNA用TT3递送，注射后6小时取肌肉组织进行免疫荧光分析。
免疫原性评估
评估TT3递送的NASAR mRNA疫苗诱导小鼠产生抗原特异性抗体的能力。
对小鼠进行初次和加强免疫，采用肌肉或皮下注射不同剂量的编码S或RBD的NASAR mRNA，于第30天采血，通过ELISA检测抗S1抗体水平。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
验证mRNA翻译效率
验证体内表达
验证免疫原性
生物信息学分析
统计分析
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 细胞培养与转染 | Opti-MEM减血清培养基 | Thermo Fisher Scientific | -- |
| Lipofectamine 3000转染试剂 | Thermo Fisher Scientific | -- | |
| mRNA合成 | AmpliScribe T7-Flash转录试剂盒 | Lucigen | -- |
| 假尿苷-5′-三磷酸 | TriLink | -- | |
| 牛痘病毒加帽系统 | NEB | -- | |
| Cap 2′-O-甲基转移酶 | NEB | -- | |
| mRNA纯化 | RNA清洁与浓缩试剂盒 | Zymo | -- |
| 荧光素酶检测 | Bright-Glo荧光素酶检测试剂盒 | Promega | -- |
| SpectraMax M5微板阅读器 | Molecular Devices | -- | |
| ELISA | Cytation 5细胞成像多功能微板读取器 | Biotek | -- |
| EZview Red ANTI-FLAG M2亲和凝胶 | Sigma-Aldrich | -- | |
| 兔抗FLAG抗体 | Abcam | ab1162 | |
| 免疫荧光 | Hoechst 33342染料 | Thermo Fisher Scientific | -- |
| 尼康Eclipse Ti倒置荧光相差显微镜 | Nikon | -- | |
| 体内成像 | Xenogen IVIS Spectrum小动物活体成像系统 | Caliper | -- |
| 组织切片 | Cryotome E冷冻切片机 | Thermo-Shandon | -- |
| 免疫荧光成像 | 尼康A1R活细胞共聚焦显微镜 | Nikon | -- |
| 纳米颗粒制备 | MC3脂质 | MedKoo | -- |
| DMG-PEG2000 | Avanti Polar Lipids | -- | |
| 胆固醇 | Sigma-Aldrich | -- | |
| 载体构建 | Q5高保真PCR试剂盒 | NEB | -- |
| pUC19载体 | -- | -- | |
| repliQa HiFi组装混合物 | QuantaBio | -- | |
| 5-alpha感受态大肠杆菌 | NEB | -- | |
| QIAprep离心柱小提试剂盒 | Qiagen | -- | |
| NanoDrop 2000分光光度计 | Thermo Fisher Scientific | -- | |
| mRNA合成 | QIAquick PCR纯化试剂盒 | Qiagen | -- |
| ELISA | HRP标记的羊抗兔IgG | Cell Signaling Technology | 7074 |
| HRP标记的山羊抗小鼠IgG | Abcam | ab7068 | |
| 重组抗刺突蛋白单克隆抗体 | Sino Biological | 40591-MM43 | |
| SARS-CoV-2刺突蛋白S1亚基肽段 | Genscript | Z03501 |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 细胞培养与转染 | Hep3B细胞培养基为EMEM+10% FBS；293T细胞培养基为DMEM+10% FBS；转染试剂为Lipofectamine 3000；mRNA用量50ng/孔；细胞密度2×10^4/孔（96孔板）。 阅读提示：见Firefly Luciferase Assay In Vitro部分 |
| mRNA合成 | 所有mRNA含cap-1结构和120A尾巴，使用假尿苷完全替代UTP；体外转录使用AmpliScribe T7-Flash转录试剂盒。 阅读提示：见Preparation of mRNA Transcripts部分 |
| TT3纳米颗粒配方 | 脂质:DOPE:胆固醇:DMG-PEG2000摩尔比20:30:40:0.75。 阅读提示：见Firefly Luciferase Assay In Vitro部分 |
| 体内荧光素酶实验 | C57BL/6小鼠，肌肉注射，mRNA剂量1.5μg/腿，每只小鼠两条腿，注射后6小时成像。 阅读提示：见Luciferase Expression Assay In Vivo部分 |
| 免疫实验 | C57BL/6小鼠，第0天初次免疫，第14天加强，剂量12、1.2、0.12、0.012μg/只；途径包括肌肉和皮下注射；第30天采血检测抗S1抗体。 阅读提示：见Immunization and Detection of Antigen-Specific Antibodies in Mice部分 |
| ELISA检测抗S1抗体 | 以重组抗刺突蛋白单克隆抗体（Sino Biological, 40591-MM43）建立标准曲线；血清需适当稀释以保证OD492在线性范围内。 阅读提示：见Immunization and Detection of Antigen-Specific Antibodies in Mice部分 |