验证NELL2表达随发育阶段增加
探讨NELL2是否参与神经元发育进程
使用NELL2抗体染色和RT-qPCR检测培养海马神经元发育阶段1-3的NELL2蛋白和mRNA水平。
关于丁香通
公司信息
个人用户
企业机构
无忧采购 轻松科研
- 移动端
NELL2在海马神经元轴突发育中的功能
NELL2 Function in Axon Development of Hippocampal Neurons.
实验完整度
中包含体外原代海马神经元培养、过表达和siRNA敲低功能验证及ERK抑制剂机制验证，但缺乏体内实验和患者样本。
主要模型
大鼠胚胎海马原代神经元
重点核对
NELL2过表达载体转染或siRNA敲低处理的神经元模型 轴突长度和分支数量的定量分析 ERK抑制剂U0126处理浓度10 μM 培养时间2天后进行形态学分析
摘要
神经元具有多个树突和单个轴突。这种神经元极性在神经元分化的早期过程中逐渐建立：多个神经突的生成（第1-2阶段）；轴突和树突的分化（第3阶段）和成熟（第4-5阶段）。在本研究中，我们使用培养的大鼠胚胎海马神经元证明，神经元特异性N-糖基化蛋白NELL2对神经元极性和轴突生长至关重要。内源性NELL2的表达随着海马神经元发育阶段的进展而逐渐增加，而过表达NELL2可促进神经元极性和轴突生长。与此一致，敲低NELL2表达导致神经元发育恶化，包括抑制神经元发育进程、减少轴突生长和增加轴突分支。针对细胞外信号调节激酶（ERK）的抑制剂显著抑制了NELL2诱导的神经元发育进程和轴突生长。这些结果表明，NELL2是神经元极性和轴突生长形态发育的重要调节因子。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- NELL2是否以及如何调控海马神经元的极性和轴突生长？
- 核心机制
- NELL2通过ERK信号通路调控神经元极性和轴突生长，而非通过Robo2或Robo3受体。
- 主要证据
- 在培养的大鼠胚胎海马神经元中，过表达NELL2促进神经突和轴突生长，knockdown减少轴突长度并导致分支异常，ERK抑制剂U0126抑制NELL2诱导的轴突形成和生长。
- 研究意义
- 揭示NELL2在神经元形态发育中的关键作用，可能为理解学习和记忆相关神经发育障碍提供基础。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
过表达NELL2对神经元极性和轴突生长的影响
确定NELL2是否促进神经元极性和轴突生长
转染pDS-NELL2-GFP或对照载体，培养2天后进行免疫细胞化学和形态学分析。
敲低NELL2对轴突形态的影响
确认内源性NELL2对正常轴突发育的必要性
使用特异性siRNA敲低NELL2，测定NELL2 mRNA水平、轴突长度、分支数量和阶段进展。
探讨NELL2下游信号通路
鉴定介导NELL2作用的信号通路
用ERK抑制剂U0126、PI3K抑制剂LY294002和MAPK抑制剂SB203580处理过表达NELL2的神经元，观察轴突形成和生长。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 细胞培养 | 木瓜蛋白酶 | Worthington Biochem | -- |
| 多聚D-赖氨酸 | Sigma-Aldrich | -- | |
| Neurobasal培养基 | Thermo Scientific | -- | |
| B27添加剂 | Gibco | -- | |
| Glutamax | Thermo Scientific | -- | |
| 细胞转染 | jetPRIME转染试剂 | Polyplus | -- |
| 细胞培养 | 人NELL2蛋白 | Sino Biological | 13132-H08B |
| 信号通路抑制 | U0126抑制剂 | Calbiochem | -- |
| LY294002抑制剂 | Sigma-Aldrich | -- | |
| SB203580抑制剂 | Calbiochem | -- | |
| 免疫细胞化学 | 兔抗NELL2抗血清 | -- | -- |
| 鸡抗Tau1抗体 | Abcam | ab75714 | |
| Alexa Fluor 594标记的山羊抗兔二抗 | Invitrogen | A11012 | |
| Alexa Fluor 488标记的山羊抗鸡二抗 | Cell Signaling Technology | 4410 | |
| 显微镜成像 | FV1200共聚焦激光扫描显微镜 | Olympus America | -- |
| EVOS FL Auto2成像系统 | Thermo Scientific | -- | |
| RNA提取 | TRIzol试剂 | Invitrogen | -- |
| RNA定量 | NanoDrop ND-1000分光光度计 | Nano Drop Technologies | -- |
| cDNA合成 | Qiagen全转录组试剂盒 | Qiagen | -- |
| 实时PCR | BrightGreen 2× qPCR预混液-ROX | ABM | -- |
| StepOnePlus实时PCR系统 | Applied Biosystems | -- | |
| siRNA合成 | FAM标记的对照siRNA | Bioneer Primer Synthesis Service | -- |
| FAM标记的NELL2 siRNA | Bioneer Primer Synthesis Service | -- | |
| siRNA转染 | Lipofectamine 3000转染试剂 | -- | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 原代神经元培养 | 胚胎年龄（E18）、种植密度（1.2×10^5细胞/皿）、内径为18mm的玻片、poly-D-lysine浓度(50μg/ml)、消化酶和消化时间 阅读提示：参照Materials and Methods的Hippocampal primary neuron culture部分 |
| NELL2过表达和敲低处理 | 转染时间（6小时后）、转染试剂（jetPRIME或Lipofectamine 3000）、siRNA浓度（100 pmole）、培养时间（2天） 阅读提示：参照Materials and Methods的RNA interference部分及图2、3的图例说明 |
| 信号通路抑制实验 | U0126浓度10μM、LY294002浓度5μM、SB203580浓度5μM、加入时间（种板后8小时） 阅读提示：参照Materials and Methods的Hippocampal primary neuron culture部分及图4图例 |
| 形态学分析 | 轴突定义（长度45μm且Tau1阳性）、分析工具（ImageJ和NeuronJ） 阅读提示：参照Materials and Methods的Analysis of images部分 |