化学物质选择与工作液制备
确定测试化学物质并准备合适浓度的孵育工作液。
从现有毒理学数据库中选取207种化学物质，制备100倍工作液，用于标准孵育，并在必要时制备DMSO储备液。
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面向内毒性关注阈值（iTTC）：使用冷冻保存悬浮肝细胞对207种化学物质进行体外肝细胞代谢测试以支持PBPK建模
Towards Internal Threshold for Toxicological Concern (iTTC): In Vitro Hepatocyte Metabolism Testing of 207 Chemicals using Cryopreserved Suspended Hepatocytes for PBPK Modeling
实验完整度
中实验包含标准化体外肝细胞清除率测定、质量控制及对参考化合物的验证，但缺乏体内功能验证或机制研究。
主要模型
大鼠肝细胞 小鼠肝细胞 兔肝细胞 犬肝细胞
重点核对
肝细胞来自Sprague-Dawley大鼠、CD-1小鼠、新西兰白兔和Beagle犬，且每个池至少来自3只供体，并采用雌雄1:1混合。 肝细胞浓度0.5×10^6 cells/ml，测试浓度0.1和1 µM，标准孵育时间点0、10、20、40、60和120分钟。 标准测定中DMSO终浓度为0.5%；挥发性化学物质使用单个密封玻璃瓶且DMSO终浓度为1%。 对照组包括热灭活肝细胞和仅培养基孵育，用于校正非特异性损失。 使用非那西丁和维拉帕米作为参考化合物，评估批间重现性和物种差异。
摘要
为推进建立内毒性关注阈值（iTTC）的合作计划，本研究生成了207种多样化化学物质的体外肝脏代谢清除数据。此处报告的数据正被用于化学特异性生理药代动力学（PBPK）建模，以将口服无可见有害作用水平（NOAELs）转化为内暴露估计值。肝细胞试验在2个浓度（0.1和1 µM）下使用多种物种的冷冻保存细胞进行，确保适用于现有的哺乳动物毒性研究。各化学物质的代谢清除率测量值差异显著，在0.1 µM时范围为0至4,294 µl/min/10^6细胞，在1 µM时范围为0至2,351 µl/min/10^6细胞。相当比例的化学物质（0.1 µM时68%，1 µM时62%）的清除率值低于30 µl/min/10^6细胞。此外，我们观察到在两个浓度下测定的固有清除率（CLint）值之间存在强相关性（R = 0.8）。这些数据有助于建立稳健的iTTC值，可用于：（i）从口服体内研究外推到皮肤和吸入暴露，（ii）基于风险的筛选来自多个暴露途径的给定物质的综合暴露，（iii）基于风险的人类生物监测结果的筛选。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- 本研究旨在为iTTC项目生成多种化学物质的体外肝脏代谢清除数据，以支持PBPK建模，将口服NOAELs转化为内暴露估计。
- 核心机制
- 文中未明确说明
- 主要证据
- 在0.1和1 µM浓度下，使用来自多物种（大鼠、小鼠、兔、犬）的冷冻悬浮肝细胞测定207种化学物质的代谢清除率；结果范围分别为0-4294和0-2351 µl/min/10^6细胞，且两个浓度间CLint显著相关（R=0.8）。
- 研究意义
- 这些数据有助于建立稳健的iTTC值，可用于口服研究外推到其他暴露途径、综合暴露筛选以及人类生物监测数据的健康保护性评估。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
分析方法开发
建立每种测试化学物质的定量检测方法。
使用LC-MS/MS或GC-MS/MS开发分析方法，确保灵敏度和特异性。
肝细胞获取与活性验证
确保肝细胞批次具有足够的代谢活性，适用于清除率测定。
从商业供应商获取冷冻保存的肝细胞，检测其第I相（ECOD）和第II相（UGT、SULT）酶活性，并与供应商报告值比较。
初步研究优化实验条件
评估参考化合物清除率的批间重现性，并确定标准实验条件。
在多个物种中，使用参考化合物（非那西丁和维拉帕米）在1 µM浓度下进行初步清除率实验，连续3天进行。
正式清除率测定
在标准条件下测定测试化学物质在肝细胞中的清除率。
将测试化学物质以0.1和1 µM浓度与肝细胞孵育，在预设时间点取样，测定剩余母体化合物，计算清除率。
质量控制与数据分析
评估数据质量，计算固有清除率（CLint）并处理不合格数据。
使用F检验确定斜率显著性，计算CLint，并区分低清除率、活性细胞清除不可测定等数据。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 分析化学 | 液相色谱-串联质谱 | -- | -- |
| 气相色谱-串联质谱 | -- | -- | |
| 细胞培养 | 24孔聚苯乙烯细胞培养板 | -- | -- |
| 48孔聚苯乙烯细胞培养板 | -- | -- | |
| 硅烷化玻璃孵育容器 | -- | -- | |
| 冷冻保存的肝细胞 | -- | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 肝细胞准备 | 肝细胞物种来源、供体数量（至少3只）和性别比例（1:1雌雄） 阅读提示：Materials and methods, 肝细胞获取段落 |
| 孵育体系 | 肝细胞浓度（0.5×10^6 cells/ml）、测试浓度（0.1和1 µM）、孵育温度（37°C）、CO2浓度（5%）、振荡速度（100 rpm）、孵育体积（500 µl或1 ml） 阅读提示：Materials and methods, 标准孵育条件段落 |
| 时间点取样 | 取样时间点（默认0, 10, 20, 40, 60, 120 min；部分快速清除化合物缩短时间点） 阅读提示：Materials and methods, 标准孵育条件段落及Results中快速清除物质重测段落 |
| 溶剂控制 | DMSO终浓度（标准0.5%，挥发性物质1%） 阅读提示：Materials and methods, 标准孵育和替代方案段落 |
| 质量控制 | 参考化合物（非那西丁和维拉帕米）的清除率，以及热灭活肝细胞和仅培养基对照的非特异性损失 阅读提示：Materials and methods, 质量控制段落及Results中参考化合物结果 |