生物信息学预测SyeA为潜在效应子
鉴定布赫纳氏菌可能分泌的宿主相互作用蛋白。
使用BastionX分析布赫纳氏菌全蛋白质组,预测T3SS效应子,发现SyeA得分最高。
A secreted endosymbiont protein essential for colonizing host cells
研究包含生物信息学预测、结构预测、异源表达、免疫荧光、PNA敲低及表型分析等多层次验证,功能与机制验证充分。
豌豆蚜(Acyrthosiphon pisum)及其内共生菌布赫纳氏菌(Buchnera aphidicola)共生体系 胚胎期合胞体 bacteriome 及成熟 bacteriocyte
SyeA在胚胎定植后定位于宿主细胞质,周围有肌动蛋白层 syeA敲低导致胚胎定植失败、发育畸形及溶酶体活性升高 SyeA与Rab7在衰老bacteriocyte中表达相关
提炼研究问题、关键发现与证据,快速把握文章的核心贡献。
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
鉴定布赫纳氏菌可能分泌的宿主相互作用蛋白。
使用BastionX分析布赫纳氏菌全蛋白质组,预测T3SS效应子,发现SyeA得分最高。
研究syeA在布赫纳氏菌中的存在模式及进化速率。
调查113个布赫纳氏菌基因组中syeA的存失,计算dN值,预测结构保守性。
寻找SyeA的功能线索,验证与病原效应子的结构相似性。
使用AlphaFold预测SyeA结构,与PDB中EspG和VirA进行结构比对。
验证SyeA的表达与检测方法。
在大肠杆菌中表达全长的SyeA和截短的SyeAΔ,利用western blot和质谱检测。
观察SyeA在布赫纳氏菌定植胚胎时的时空分布。
使用免疫荧光显微镜检测不同发育阶段胚胎中SyeA的分布。
验证SyeA对定植和胚胎发育的功能必要性。
注射anti-syeA PNA,检测syeA转录水平、胚胎表型及溶酶体活性。
按研究目的归类文中使用的方法,便于定位所需技术。
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 抗体生产 | 抗SyeA多克隆抗体 | Biomatik | -- |
| 免疫荧光 | 山羊抗兔Alexa Fluor 647二抗 | Thermo Fisher Scientific | A21245 |
| 抗Rab7单克隆抗体 | Sigma-Aldrich | R8779 | |
| 山羊抗小鼠IgG2b Alexa Fluor 568二抗 | Thermo Fisher Scientific | A21144 | |
| 荧光标记鬼笔环肽 | Biotium | 0042T | |
| 麦胚凝集素CF488 | Biotium | 29022 | |
| DAPI | -- | -- | |
| 异源表达 | pET28b载体 | -- | -- |
| Arctic Express细胞 | Agilent | -- | |
| 异丙基硫代半乳糖苷 | -- | -- | |
| Gibson组装预混液 | New England Biolabs | -- | |
| 无细胞表达 | NEBExpress无细胞大肠杆菌蛋白合成系统 | New England Biolabs | -- |
| PURExpress体外蛋白合成试剂盒 | New England Biolabs | -- | |
| 蛋白纯化 | 镍树脂离心柱 | -- | -- |
| 蛋白检测 | 抗His6标签抗体 | -- | -- |
| 山羊抗兔Alexa Fluor 680二抗 | Abcam | -- | |
| Odyssey CLx成像系统 | LI-COR Biosciences | -- | |
| 考马斯亮蓝G-250 | -- | -- | |
| RNA提取 | TRIzol试剂 | MRI | -- |
| Zymo Direct-zol RNA提取试剂盒 | Zymo Research | R2052 | |
| cDNA合成 | PrimeScript cDNA合成试剂盒 | Takara Bio | RR037A |
| 数字PCR | QIAcuity One数字PCR仪 | Qiagen | -- |
| QIAcuity 3× EvaGreen PCR预混液 | Qiagen | 250113 | |
| 24孔26K纳米板 | Qiagen | 250001 | |
| 免疫荧光成像 | 尼康Eclipse荧光显微镜 | Nikon | -- |
| 尼康AXR-NSPARC激光扫描共聚焦显微镜 | Nikon | -- | |
| 显微注射 | Narishige IM-400显微注射器 | Narishige | -- |
| 电镜 | Jeol 1400Flash透射电子显微镜 | Jeol | -- |
| 溶酶体染色 | LysoView640溶酶体染料 | Biotium | -- |
| 显微注射耗材 | 斜角5微升校准移液管 | VWR | -- |
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| SyeA定植胚胎的免疫荧光 | 胚胎发育阶段(7-14)、抗体浓度(5 µg/ml)、孵育条件(4°C过夜)、固定条件(3.7%甲醛)、成像设置 阅读提示:Methods: Immunofluorescence microscopy; Figure legends 4 and Extended Data Fig. 6 |
| PNA敲低实验 | 蚜虫龄期(4-5天或7天)、PNA序列(anti-syeA: TGTTCAGGAATT; control: AAGTCTTATGGT)、注射体积(约0.1 µl)、PNA浓度(100 µM)、采样时间(24小时或7天)、样本量(12只/组) 阅读提示:Methods: syeA knockdown with PNA; Figure legend 6 |
| 溶酶体活性检测 | 蚜虫龄期(4-5天)、LysoView640浓度(1×)、孵育时间(30分钟)、样本量(147-158个bacteriocyte) 阅读提示:Methods: Lysosome quantification after knockdown; Figure legend 6e,f |