检测P4HB在OS组织和细胞中的表达
评估P4HB在OS中的表达水平，确定其与OS的相关性。
通过RT-qPCR和Western blot检测骨肉瘤患者肿瘤组织、癌旁组织及OS细胞系（SaOS-2、MG-63、U2OS、HOS、MNNG/HOS Cl #5、143B）和正常成骨细胞（hFOB 1.19）中P4HB mRNA和PDI蛋白的表达。
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FTO介导的蛋白质二硫键异构酶m6A修饰激活VEGFA-VEGFR2信号抑制骨肉瘤程序性细胞死亡
FTO-mediated m6A modification of protein disulfide-isomerase activates VEGFA-VEGFR2 to suppress programmed cell death in osteosarcoma
实验完整度
高包含RT-qPCR、Western blot、CCK-8、Transwell、ELISA、Co-IP、m6A定量、RNA pull-down等体外实验，以及异种移植和肺转移模型等体内验证，机制验证完整。
主要模型
骨肉瘤细胞系（SaOS-2、MG-63、U2OS、HOS、MNNG/HOS Cl #5、143B） 正常成骨细胞系hFOB 1.19 BALB/c裸鼠异种移植模型 NSG小鼠肺转移模型
重点核对
P4HB在OS组织及细胞系中的表达上调：RT-qPCR和Western blot验证 P4HB敲低/过表达对OS细胞增殖、迁移、侵袭及PCD的影响 P4HB通过VEGFA-VEGFR2信号调控PCD：Co-IP验证PDI与VEGFA结合，Western blot检测VEGFA/p-VEGFR2 FTO降低P4HB m6A水平并调控其表达：m6A定量、RNA pull-down、FTO敲低/过表达 体内实验：FTO或P4HB敲低抑制裸鼠肿瘤生长及NSG小鼠肺转移
摘要
骨肉瘤（OS）是一种原发性骨恶性肿瘤，诱导程序性细胞死亡（PCD）可阻碍其进展。蛋白质二硫键异构酶（PDI）调节癌细胞死亡；然而，其在OS中的功能作用仍不清楚。通过RT-qPCR评估了OS患者肿瘤组织和细胞中P4HB的表达。评估了P4HB对OS细胞系的影响。使用Western blotting评估P4HB对各种形式PCD（凋亡、铁死亡和焦亡）的影响。生物信息学分析确定了P4HB在OS进展中的上游和下游机制。进行异种移植肿瘤发生研究以阐明P4HB在OS进展中的作用和机制。在OS组织样本和细胞系中观察到P4HB表达升高。下调P4HB抑制了OS细胞生长、迁移和侵袭，并诱导了PCD。功能富集分析和实验验证表明，PDI上调了血管内皮生长因子A（VEGFA）-血管内皮生长因子受体2（VEGFR2）信号。甲基化分析显示，m6A去甲基化酶脂肪量和肥胖相关蛋白（FTO）降低了OS细胞中P4HB的m6A水平，并增强了VEGFA–VEGFR2信号。此外，FTO过表达增强了OS细胞的增殖、迁移和侵袭能力，并减少了PCD。最后，FTO敲低通过降低PDI/VEGFA–VEGFR2信号轴的活性抑制了OS的肿瘤生长和肺转移。机制上，FTO介导的P4HB m6A修饰通过激活该轴调节OS中的PCD。 © 2026大不列颠及爱尔兰病理学会。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- PDI（P4HB）在骨肉瘤进展中的功能作用及其调控PCD的分子机制是什么？
- 核心机制
- FTO介导的P4HB m6A去甲基化上调P4HB表达，通过增强VEGFA-VEGFR2信号通路抑制骨肉瘤细胞凋亡、铁死亡和焦亡。
- 主要证据
- OS组织及细胞系中P4HB表达上调；P4HB敲低抑制细胞增殖、迁移、侵袭并诱导PCD，过表达则相反；Co-IP证明PDI与VEGFA结合；FTO敲低增加P4HB m6A水平并降低P4HB及VEGFA-VEGFR2信号；体内实验证实FTO或P4HB敲低抑制肿瘤生长和肺转移。
- 研究意义
- 揭示FTO/PDI/VEGFA-VEGFR2信号轴是骨肉瘤进展的关键调控因子，为骨肉瘤治疗提供了潜在的靶向策略。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
评估P4HB对OS细胞功能的影响
确定P4HB表达变化对OS细胞增殖、迁移、侵袭和凋亡的影响。
在U2OS和143B细胞中敲低或过表达P4HB，通过CCK-8检测细胞活力，克隆形成检测增殖，流式细胞术检测凋亡，Transwell检测迁移和侵袭，Western blot检测细胞周期（CDK4、CDK6）和迁移标志物（MMP-2、MMP-9）。
验证P4HB对PCD的调控作用
明确P4HB对凋亡、铁死亡和焦亡的影响。
检测PCD相关指标（LDH、MDA、Fe2+），Western blot检测凋亡标志物（BCL2、BAX、caspase-3）、铁死亡标志物（GPX4、SLC7A11）和焦亡标志物（cleaved caspase-1、GSDMD-NT）。使用抑制剂Z-VAD-FMK、Fer-1和Disulfiram处理，评估对PCD的影响。
探索P4HB的下游机制：VEGFA-VEGFR2信号
确定P4HB是否通过VEGFA-VEGFR2信号调控PCD。
通过GO和KEGG富集分析预测PDI相互作用蛋白参与的通路，Western blot检测P4HB敲低或过表达对VEGFA、VEGFR2、p-VEGFR2表达的影响，Co-IP验证PDI与VEGFA的相互作用。
验证FTO对P4HB的m6A修饰调控
确定FTO是否通过m6A去甲基化调控P4HB表达。
使用SRAMP预测P4HB m6A位点，检测OS细胞中整体m6A水平和相关酶的表达，在U2OS中敲低FTO或在143B中过表达FTO，通过m6A定量、RNA pull-down检测FTO与P4HB的相互作用，Western blot检测P4HB和VEGFA-VEGFR2信号的变化。
体内验证FTO和P4HB对OS肿瘤生长和转移的影响
验证FTO和P4HB在体内对OS肿瘤生长和肺转移的作用。
将sh-FTO、sh-P4HB或对照U2OS细胞腹膜内注射到裸鼠，建立异种移植模型，监测肿瘤体积和重量，进行H&E和免疫组化（Ki-67、FTO、PDI、VEGFA、p-VEGFR2）分析。将sh-FTO、sh-P4HB或对照143B细胞尾静脉注射到NSG小鼠，评估肺转移。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
生物信息学分析
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 细胞培养 | DMEM培养基 | -- | -- |
| 胎牛血清 | -- | -- | |
| 青霉素-链霉素 | -- | -- | |
| 细胞转染 | Lipofectamine 2000转染试剂 | Thermo Fisher Scientific | -- |
| RT-qPCR | TRIzol试剂 | Invitrogen | -- |
| 反转录试剂盒 | Takara Bio | -- | |
| Bio-Rad CFX96实时荧光定量PCR系统 | Bio-Rad Laboratories | -- | |
| m6A定量 | EpiQuik™ m6A RNA甲基化定量试剂盒 | EpiGentek | -- |
| Infinite M200 Pro酶标仪 | Tecan | -- | |
| CCK-8检测 | CCK-8试剂 | Dojindo | -- |
| DNM-9606酶标仪 | Perlong Medical | -- | |
| 克隆形成实验 | 结晶紫 | Sigma-Aldrich | -- |
| 凋亡检测 | Annexin V/PI细胞凋亡试剂盒 | DOJINDO | -- |
| BD Accuri C6流式细胞仪 | BD Biosciences | -- | |
| Transwell | 基质胶 | Sigma-Aldrich | -- |
| Leica DMi8显微镜 | Leica Microsystems | -- | |
| ELISA | ELISA试剂盒 | Westang | -- |
| 蛋白提取 | RIPA裂解液 | Solarbio | -- |
| 蛋白定量 | BCA蛋白定量试剂盒 | Leagene Biotech | -- |
| Western blot | PVDF膜 | -- | -- |
| Odyssey® CLx成像系统 | Gene Company Limited | -- | |
| Image Studio Lite软件 | LI-COR Biosciences | -- | |
| 抗PDI抗体 | Cell Signaling Technology | 3501 | |
| 抗CDK4抗体 | Proteintech | 110261-AP | |
| 抗CDK6抗体 | Cell Signaling Technology | 3136 | |
| 抗cyclin-D1抗体 | Proteintech | 60186-1-Ig | |
| 抗MMP-2抗体 | Cell Signaling Technology | 40994 | |
| 抗MMP-9抗体 | Cell Signaling Technology | 13667 | |
| 抗GPX4抗体 | Abcam | ab125066 | |
| 抗SLC7A11抗体 | Thermo Fisher Scientific | 711589 | |
| 抗BCL2抗体 | Thermo Fisher Scientific | MA5-11757 | |
| 抗BAX抗体 | Proteintech | 50599-2-Ig | |
| 抗caspase-3抗体 | Cell Signaling Technology | 14220 | |
| 抗pro-caspase-1抗体 | Abcam | ab179515 | |
| 抗cleaved caspase-1抗体 | Abcam | ab179515 | |
| 抗GSDMD抗体 | Abcam | ab246711 | |
| 抗VEGFA抗体 | Abcam | ab51745 | |
| 抗VEGFR2抗体 | Abcam | ab315238 | |
| 抗p-VEGFR2抗体 | Abcam | ab5473 | |
| 抗GAPDH抗体 | Cell Signaling Technology | 3683 | |
| 免疫共沉淀 | Protein A/G琼脂糖珠 | Daian Biotech | -- |
| IgG对照抗体 | Proteintech | 30000-0-AP | |
| 动物实验 | 游标卡尺 | Mitutoyo | -- |
| 组织学 | H&E染色试剂盒 | Sigma-Aldrich | -- |
| 免疫组化 | DAB显色液 | Agilent Technologies | -- |
| Leica DM2700光学显微镜 | Leica | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 细胞培养与转染 | 细胞系来源、培养基成分（DMEM+10%FBS+青霉素/链霉素）、转染试剂（Lipofectamine 2000）及转染时间 阅读提示：Materials and methods, 'Cell culture and transfection' |
| P4HB敲低/过表达 | shRNA序列、转染效率验证时间点、P4HB表达水平检测 阅读提示：Materials and methods, 'Cell culture and transfection'; Results, Figure 1 |
| 细胞功能检测 | CCK-8细胞密度（3×10^3）、克隆形成培养时间（10天）、Transwell细胞数（5×10^4）及血清浓度（20% FBS） 阅读提示：Materials and methods, 'CCK-8 assay', 'Colony formation assay', 'Transwell assays' |
| PCD标志物检测 | 抑制剂浓度（Z-VAD-FMK 20μM、Fer-1 1μM、Disulfiram 1μM）、ELISA检测的LDH/MDA/Fe2+、Western blot抗体及稀释度 阅读提示：Materials and methods, 'ELISA', 'Western blotting'; Results, Figure 2 |
| VEGFA-VEGFR2信号检测 | 抗体（VEGFA 1:500、VEGFR2 1:1000、p-VEGFR2 1:1000）、Co-IP条件 阅读提示：Materials and methods, 'Co-immunoprecipitation', 'Western blotting'; Results, Figure 3 |
| m6A检测 | m6A定量试剂盒、RNA pull-down条件、SRAMP预测的m6A位点 阅读提示：Materials and methods, 'm6A quantification', 'Prediction of methylation on P4HB' |
| 体内实验 | 动物品系（BALB/c裸鼠、NSG小鼠）、细胞注射数量（1×10^6）、观察时间（28天、2个月）、肿瘤体积计算公式 阅读提示：Materials and methods, 'Xenografts of nude mice', 'In vivo lung metastasis assay'; Results, Figure 6 |