在人胰岛细胞中敲低MYT1或ST18
探究MYT1和ST18在正常人β细胞中的作用。
使用慢病毒载体在原代人类β细胞中敲低MYT1或ST18，并通过qRT-PCR验证敲低效率。
关于丁香通
公司信息
个人用户
企业机构
无忧采购 轻松科研
- 移动端
糖尿病相关的MYT1和ST18基因通过其他糖尿病风险基因调控人β细胞胰岛素分泌和存活
Diabetes-associated MYT1 and ST18 genes regulate human beta cell insulin secretion and survival via other diabetes risk genes
实验完整度
高包含体外培养和异种移植小鼠模型两个独立证据层级，并有功能验证（GSIS、存活）和机制验证（RNA-seq、scRNA-seq、Ca2+成像）。
主要模型
原代人胰岛β细胞（pseudo-islet, PSI） NSG-DTR小鼠前眼房异种移植模型
重点核对
MYT1和ST18的敲低效率（shRNA） 体外培养和体内移植条件下β细胞死亡和功能变化 RNA-seq和scRNA-seq分析中的差异表达基因和通路 葡萄糖刺激的Ca2+内流变化
摘要
目的/假说：遗传和环境因素共同导致胰岛β细胞衰竭，进而引发2型糖尿病。这些因素如何整合在一起调控β细胞仍 largely 不清楚。基于我们之前的发现，即髓鞘转录因子家族（MYT TFs；包括MYT1、MYT1L和ST18）通过抑制应激反应的过度激活来防止小鼠β细胞衰竭，以及它们在人类β细胞中受肥胖相关营养信号的调控及其与2型糖尿病的关联，我们假设这些因子在正常生理条件和肥胖相关应激下可防止人β细胞衰竭。方法：使用shRNA在原代人β细胞中敲低MYT1或ST18。在正常条件或肥胖相关应激下，将胰岛细胞体外培养或异种移植到小鼠体内后，检测β细胞存活、分泌功能和基因表达。结果：在培养中，MYT1敲低（KD）导致β细胞死亡，而ST18-KD损害了葡萄糖刺激的胰岛素分泌。在肥胖诱导的应激下作为异种移植物，ST18-KD也导致β细胞死亡。相应地，MYT1-KD使与细胞死亡和细胞应激反应相关的几个基因和基因集失调，而ST18-KD使调节应激反应、线粒体和离子通道的基因失调。与这些基因表达变化相对应，ST18-KD减少了β细胞中葡萄糖刺激的Ca2+内流。此外，MYT1和ST18调控的基因富集了2型糖尿病相关位点，相对于β细胞表达基因的随机分布，富集倍数为2.05倍。结论/解释：MYT转录因子相互补充，整合遗传和环境因素以防止β细胞衰竭和2型糖尿病，其主要作用施加于β细胞活力和/或Ca2+内流。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- MYT1和ST18是否以及如何整合遗传和环境因素以调控人β细胞功能，防止β细胞衰竭和2型糖尿病？
- 核心机制
- MYT1和ST18通过调控与2型糖尿病相关的风险基因，协同作用以维持β细胞存活和葡萄糖刺激的胰岛素分泌（GSIS），其中MYT1主要影响细胞存活，ST18主要影响GSIS和应激条件下的存活。
- 主要证据
- 在人胰岛细胞中敲低MYT1或ST18后，观察到MYT1-KD导致β细胞凋亡，ST18-KD损害GSIS并减少葡萄糖诱导的Ca2+内流；RNA-seq和scRNA-seq显示失调的基因富集于2型糖尿病相关位点。
- 研究意义
- 研究表明MYT转录因子是整合遗传和环境因素、防止β细胞衰竭和2型糖尿病的关键调节因子，操控MYT1和ST18活性可能为预防β细胞衰竭和2型糖尿病提供策略。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
体外分析β细胞存活和分泌功能
测定MYT1或ST18敲低对β细胞存活和GSIS的影响。
通过DAPI和TUNEL染色检测细胞死亡，通过分泌实验测定胰岛素和胰高血糖素分泌。
异种移植小鼠模型验证体内作用
在体内条件下评估MYT1或ST18敲低对β细胞存活和功能的影响，以及肥胖应激下的影响。
将伪胰岛移植到NSG-DTR小鼠前眼房，并在正常饮食或高脂饮食条件下饲养，然后回收移植体进行TUNEL和激素染色。
转录组分析（RNA-seq和scRNA-seq）
鉴定MYT1或ST18敲低导致的基因表达变化和通路。
对伪胰岛进行批量RNA-seq，对β细胞进行scRNA-seq，并使用DESeq2和GSEA分析差异表达基因和通路。
线粒体和Ca2+功能分析
探究ST18敲低影响GSIS的机制，特别是线粒体和Ca2+信号。
通过超分辨率显微镜测量线粒体体积和胰岛素颗粒数量，使用荧光成像和RCaMP报告基因检测葡萄糖刺激的Ca2+内流。
基因重叠分析
检验MYT1和ST18调控的基因是否与2型糖尿病风险基因相关。
将MYT1或ST18敲低后的差异表达基因与2型糖尿病相关基因列表（GWAS, Suzuki, Walker）进行重叠分析，使用超几何检验。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 细胞培养 | CMRL1066培养基 | -- | -- |
| Vasculife基础培养基 | -- | -- | |
| 胎牛血清 | -- | -- | |
| Glutamax添加剂 | -- | -- | |
| HEPES缓冲液 | -- | 7365-45-9 | |
| 重组人VEGF | R&D Systems | -- | |
| 表皮生长因子 | R&D Systems | -- | |
| 碱性成纤维细胞生长因子 | R&D Systems | -- | |
| 胰岛素样生长因子1 | R&D Systems | -- | |
| 抗坏血酸 | R&D Systems | 50-81-7 | |
| 氢化可的松半琥珀酸酯 | R&D Systems | -- | |
| 硫酸肝素 | R&D Systems | -- | |
| LifeFactor庆大霉素/两性霉素 | R&D Systems | -- | |
| iCell内皮细胞培养基添加剂 | R&D Systems | -- | |
| 抗粘附冲洗液 | Nacalai | 4860-900SP | |
| 动物实验 | NSG-DTR小鼠 | The Jackson Laboratory | 027976 |
| 高脂饮食 | Fisher Scientific | -- | |
| Lab Diet饲料 | Lab Diet | -- | |
| Humalog胰岛素 | -- | -- | |
| 细胞凋亡检测 | TUNEL检测试剂盒 | Invitrogen | -- |
| 免疫荧光染色 | 抗PDX1抗体 | -- | -- |
| 抗生长抑素抗体 | Millipore | AB_22555365 | |
| 抗生长抑素抗体 | Santa Cruz Biotechnology | AB_2195930 | |
| 抗胰多肽抗体 | Abcam | AB_3065109 | |
| 抗TOMM20抗体 | Abcam | AB_3065091 | |
| 抗胰岛素抗体 | Dako | AB_10013624 | |
| 抗胰高血糖素抗体 | Dako | AB_2234057 | |
| 抗MYT1抗体 | in-house | -- | |
| 抗ST18抗体 | in-house | -- | |
| 抗MafA抗体 | Novus | AB_1503594 | |
| 抗NKX6.1抗体 | Developmental Studies Hybridoma Bank | F55A10 | |
| 二抗 | Jackson ImmunoResearch | -- | |
| 成像 | DAPI染色液 | -- | -- |
| 共聚焦显微镜FV1000 | Olympus | -- | |
| Leica 880共聚焦显微镜 | Leica | -- | |
| 图像分析 | ImageJ软件 | -- | -- |
| 分泌检测 | 胰岛素ELISA试剂盒 | Alpco | -- |
| 胰高血糖素ELISA试剂盒 | Mercodia | -- | |
| 分子生物学 | 无DNA RNA提取试剂盒 | Zymo Research | -- |
| cDNA合成试剂盒 | Promega | -- | |
| SYBR Green预混液 | Bio-Rad Laboratories | -- | |
| 测序 | NovaSeq 6000测序仪 | Illumina | -- |
| 线粒体检测 | MitoView 633线粒体染料 | -- | -- |
| Ca2+成像 | RCaMP钙指示剂 | -- | -- |
| 玻璃底培养皿（D35-14-1.5P） | Cellvis | -- | |
| 病毒包装 | HEK293细胞 | -- | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 人胰岛细胞培养和伪胰岛生成 | 人胰岛供体信息、纯度、存活率、刺激指数；培养基组成（VPM）；细胞数量（200,000/孔）；病毒量（40-50 ng）；培养时间（5天） 阅读提示：Methods: Human donor islet and mouse usage, Pseudo-islet production |
| 基因敲低验证 | shRNA序列（MYT1-Si3, ST18-Si4）和敲低效率（qRT-PCR验证） 阅读提示：Methods: Lentiviral vector production, qRT-PCR |
| 体外功能检测 | 葡萄糖浓度（G2.8和G16.7）、刺激时间（45 min）、预孵育条件（1 h）、PSI数量（15-20个/孔） 阅读提示：Methods: Secretion assays, Figure 1e-h legend |
| 异种移植 | 小鼠品系（NSG-DTR）、移植数量（约30 PSI）、移植部位（前眼房）、移植后恢复时间（4周）、饮食干预（对照饮食或HFD 12周） 阅读提示：Methods: Pseudo-islet production, transplantation and insulin tolerance tests, Figure 3 legend |
| RNA-seq和scRNA-seq | RNA完整性（RIN≥7.6）、测序平台（NovaSeq 6000）、测序深度（100-120 million reads/sample）、分析参数（DESeq2, Seurat） 阅读提示：Methods: RNA-seq, single-cell RNA-seq and function annotation, ESM Methods |
| Ca2+成像 | 细胞处理（shRNA感染3天，RCaMP腺病毒感染过夜）、缓冲液（KRB, G1）、刺激方案（G11 25 min, KCl 30 mmol/l）、成像参数（5 s/frame） 阅读提示：Methods: Ca2+ imaging, Figure 6 legend |
| 线粒体功能检测 | 染色（TOMM20免疫荧光, MitoView 633）、检测方法（流式或超分辨率显微镜） 阅读提示：Methods: Mitochondria and insulin assays, ESM Methods, ESM Fig. 6 |