PCIS模型的制备与培养
建立来自CD患者和非CD患者的回肠和结肠离体组织培养模型，保留组织结构和细胞组成。
从手术切除组织中制备PCIS，厚度约300μm，培养于WME培养基中，在37°C、95% O2/5% CO2条件下振荡培养。
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区域特异性免疫调节决定克罗恩病离体模型中JAK1抑制剂的差异性反应
Region-specific immune regulation determines differential response to JAK1 inhibition in Crohn's disease ex vivo
实验完整度
高包含患者来源组织离体培养、免疫刺激、药物处理、多重细胞因子检测、转录组测序及氧化应激分析等多个独立证据层级。
主要模型
克罗恩病患者的回肠和结肠精密切割肠片（PCIS） 非克罗恩病患者的回肠和结肠精密切割肠片（PCIS）
重点核对
PCIS来自克罗恩病患者的炎症组织，以及非CD患者切除边缘的健康组织 刺激条件：10 μg/mL ConA或10 μL/mL anti-CD3/CD28 filgotinib浓度：100 nM 培养时间：24小时 技术重复：每个供体两个孔，每个孔两个PCIS
摘要
克罗恩病（CD）仍然是一个重大的治疗挑战，治疗选择有限且临床反应异质性。选择性JAK1抑制剂filgotinib在治疗溃疡性结肠炎方面显示出巨大潜力，但在CD中未能表现出一致的疗效，其原因尚不清楚。在此，我们利用来自CD患者的免疫活性离体精密切割肠片（PCIS）模型来填补这一空白，该模型允许对回肠和结肠反应进行区域特异性分析。我们发现结肠PCIS表现出强烈的T细胞活化，并对filgotinib高度敏感，在离体条件下抑制Th1/Th17细胞因子、氧化应激和STAT信号。相比之下，回肠PCIS主要表现为先天性和Th17驱动的炎症，对JAK1抑制的敏感性较低。这些数据为filgotinib在CD临床试验中疗效有限提供了潜在的机制解释，并将PCIS确立为一种人类相关的离体模型，用于研究区域特异性药物反应，强调了在炎症性肠病中开发针对肠道不同节段定制疗法的重要性。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- 回肠和结肠克罗恩病（CD）组织对JAK1抑制（filgotinib）的敏感性是否存在区域特异性差异，以及这种差异是否与不同的免疫程序相关。
- 核心机制
- 结肠CD组织具有更强的可诱导T细胞和JAK/STAT相关炎症程序，对JAK1抑制更敏感；回肠CD组织则具有更广泛的先天性和Th17驱动的炎症，对JAK1抑制的依赖性较低。
- 主要证据
- 使用CD患者来源的回肠和结肠PCIS，通过ConA刺激和filgotinib处理，检测了细胞因子释放、转录组变化及氧化应激指标，发现结肠PCIS中Th1/Th17相关细胞因子（如IL-17F、IL-22）和T细胞活化基因（如TRAC、CD3D）被显著抑制，而回肠PCIS中这些变化较弱或缺失。
- 研究意义
- 研究提供了filgotinib在CD临床试验中疗效有限的潜在机制解释，并支持PCIS作为研究区域特异性药物反应的人类离体模型，强调了开发针对肠道不同节段定制疗法的重要性。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
基线免疫特征分析
评估未刺激条件下回肠和结肠PCIS的免疫和转录特征差异。
检测基础介质分泌（细胞因子/趋化因子）、进行全组织免疫荧光染色（ZO-1, occludin）和mRNA测序。
免疫刺激反应分析
比较在免疫刺激下回肠和结肠PCIS的可诱导炎症反应。
用ConA或anti-CD3/CD28刺激PCIS 24小时，然后分析分泌介质和转录组变化。
filgotinib剂量优化
确定离体PCIS中filgotinib的非毒性浓度和有效浓度。
在非CD衍生的PCIS中测试不同浓度（1-100 nM）的filgotinib，评估毒性和对介质分泌的抑制效果。
药物反应评估
评估filgotinib对ConA刺激的回肠和结肠CD-PCIS的炎症反应的影响。
用ConA和filgotinib（100 nM）共同处理PCIS，分析介质分泌、mRNA表达和氧化应激指标。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 组织制备 | 3%低熔点琼脂糖 | Fisher | 10583355 |
| 组织培养 | WME培养基 | Gibco | 32551020 |
| D-葡萄糖 | Sigma | C8270 | |
| 抗生素-抗真菌剂 | Gibco | 15240062 | |
| 免疫刺激 | 伴刀豆球蛋白A | Sigma | C5275 |
| ImmunoCult人类CD3/CD28 T细胞激活剂 | STEMCELL Technologies | 10971 | |
| 药物处理 | 非戈替尼 | MCE | HY-18300 |
| 二甲基亚砜 | -- | -- | |
| 活性检测 | LDH细胞毒性检测试剂盒 | Roche | 11644793001 |
| 组织处理 | Triton X-100 | Sigma | -- |
| 固定和包埋 | 10%中性缓冲福尔马林 | -- | -- |
| 免疫荧光染色 | 抗occludin小鼠单克隆抗体 | Invitrogen | 33-1500 |
| 抗ZO-1兔多克隆抗体 | Invitrogen | 61-7300 | |
| AlexaFluor 568偶联的山羊抗兔IgG H&L | Abcam | ab175471 | |
| AlexaFluor 647偶联的山羊抗小鼠IgG H+L | Jackson ImmunoResearch | 115-605-003 | |
| DAPI | Sigma | D9542 | |
| ibidi封片剂 | ibidi | 50001 | |
| 显微镜成像 | 蔡司LSM 800共聚焦显微镜 | Zeiss | -- |
| 图像分析 | IMARIS 9.2.1 | Bitplane | -- |
| 介质分析 | Meso Scale Discovery定制U-PLEX检测 | Mesoscale Diagnostic | -- |
| MESO QuickPlex SQ120 | Mesoscale Diagnostic | -- | |
| 细胞因子检测 | DuoSet ELISA试剂盒 | R&D | -- |
| RNA保存 | RNAlater | Invitrogen | AM7021 |
| RNA测序 | NovaSeq X Plus | Illumina | -- |
| 氧化应激检测 | DCF活性氧/氮检测 | Abcam | ab238535 |
| Pierce BCA蛋白检测试剂盒 | Thermo Fisher | 23225 | |
| 氮氧化物检测 | 一氧化氮检测试剂盒 | Invitrogen | EMSNO |
| 离心 | 超滤离心管（Pierce浓缩器） | Pierce | -- |
| 读取 | 酶标仪Infinite 200 Pro | Tecan | -- |
| 软件分析 | GraphPad Prism | GraphPad | -- |
| 蛋白质检测 | 蛋白酶抑制剂混合物 | Thermo Fisher Scientific | 87785 |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| PCIS制备与培养 | 组织来源（CD患者的炎症部位和非CD患者的健康部位）、切片厚度（约300 μm）、培养基（WME）、补充成分（D-葡萄糖、抗生素）、培养时间（24小时）及振动速度（90 rpm）。 阅读提示：Methods 2.2 |
| 免疫刺激 | ConA浓度（10 μg/mL）、anti-CD3/CD28体积（10 μL/mL），刺激时间（24小时）。 阅读提示：Methods 2.2 |
| 药物处理 | filgotinib浓度（100 nM）、DMSO对照浓度（0.05%），处理时间（24小时）。 阅读提示：Methods 2.2 |
| 细胞因子/介质检测 | 检测方法（MSD U-PLEX、ELISA）、检测的介质列表及其定量下限、样本保存条件。 阅读提示：Methods 2.6 |
| 转录组分析 | RNA完整性（RIN>7）、测序平台（NovaSeq X Plus）、测序深度（每个样本30M reads）、比对和差异表达分析参数。 阅读提示：Methods 2.7, 2.8 |
| 氧化应激分析 | ROS/RNS检测方法（DCF）、NOx检测方法、蛋白质归一化方法。 阅读提示：Methods 2.9, 2.10 |