建立Dlc1条件性敲除小鼠模型
评估内皮细胞中Dlc1的生理功能，尤其是胚胎发育和成体骨髓中的作用
构建Dlc1floxed小鼠，与Cdh5-Cre或Cdh5-CreERT2工具鼠杂交，实现内皮特异性的组成型或诱导型Dlc1缺失。通过他莫昔芬诱导（100 mg/kg口服，连续3天）实现成体缺失。
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内皮Dlc1在胚胎血管发育和成体骨髓造血中的作用
Role of endothelial Dlc1 in embryonic vascular development and adult bone marrow hematopoiesis
实验完整度
高包含胚胎和成体遗传模型、细胞系共培养、单细胞测序及配体-受体分析等多层级验证，并明确功能验证和机制探索。
主要模型
Cdh5-Cre诱导的内皮细胞特异性Dlc1敲除小鼠模型 Cdh5-CreERT2诱导的成年小鼠内皮细胞特异性Dlc1敲除模型 BMEC-Akt小鼠骨髓内皮细胞系
重点核对
内皮细胞特异性Dlc1缺失小鼠的基因型鉴定（胚龄E11.5和E13.5） 他莫昔芬给药方案（100 mg/kg口服，连续3天）和诱导时间（胚胎E8.5-E10.5或成年3-4周龄） 骨髓血管形态学量化指标（血管覆盖、血管段数、血管直径） 流式细胞术分析造血祖细胞和成熟细胞群（如LSK、MPP3、粒细胞、单核细胞） 单细胞RNA-seq中Dlc1缺失内皮亚群的转录组特征及差异表达基因
摘要
骨髓内皮细胞形成支持造血干祖细胞（HSPC）的特化血管微环境，然而其功能的分子调控机制仍不完全清楚。在此，我们确定Rho GTP酶激活蛋白Dlc1是发育性血管发生和成体骨髓血管微环境完整性的关键调控因子。内皮特异性Dlc1缺失导致胚胎致死并伴有严重的血管缺陷。在成体小鼠中，诱导性内皮特异性Dlc1缺失破坏了骨髓血管结构，并与多能造血祖细胞和髓系细胞显著减少相关。单细胞RNA测序揭示了Dlc1缺陷内皮细胞的转录重编程，出现了转录谱改变并破坏了关键微环境信号（包括Kitl、Cxcl12和Pdgfb）表达的新型细胞亚群。配体-受体相互组分析表明内皮细胞到造血细胞的通讯受损，且造血细胞表现出代谢应激和生物合成活性降低的转录特征。这些发现将Dlc1定位为发育性血管发生、骨髓成体血管结构和内皮细胞来源的造血支持的关键调控因子。这项工作揭示了Dlc1在将血管功能与造血输出耦合中的先前未被认识的作用，对理解骨髓衰竭综合征和靶向血液病中的内皮功能障碍具有重要意义。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- 内皮Dlc1在胚胎血管发育和成体骨髓造血中的功能作用是什么？
- 核心机制
- 内皮Dlc1缺失导致内皮细胞转录重编程，特别是下调关键微环境信号（如Kitl、Cxcl12和Pdgfb），破坏内皮-造血通讯，从而损害造血支持。
- 主要证据
- 通过内皮特异性Dlc1敲除小鼠模型，观察到胚胎致死和血管缺陷；成体小鼠骨髓血管异常和造血祖细胞减少；体内外共培养实验显示造血支持受损；单细胞测序和配体-受体分析揭示信号通路改变。
- 研究意义
- 该研究揭示了Dlc1在骨髓血管微环境中的关键作用，为理解骨髓衰竭综合征和靶向血液病中的内皮功能障碍提供了新视角。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
胚胎表型分析
确定内皮Dlc1缺失是否导致胚胎致死和血管发育缺陷
在E11.5和E13.5收集胚胎，通过体视显微镜观察形态，进行H&E染色和CD34免疫染色，以及全组织光学清除和共聚焦成像评估血管网络。
成体骨髓血管分析
评估成年小鼠内皮Dlc1缺失后骨髓血管结构的变化
对4周龄经他莫昔芬处理的小鼠进行骨髓血管成像，通过光学清除和共聚焦显微镜观察血管形态，并定量分析血管覆盖、血管段数和血管直径。
流式细胞术分析造血细胞
检测内皮Dlc1缺失对骨髓造血干祖细胞和成熟细胞数量的影响
从骨髓中分离细胞，通过流式细胞术分析LSK、MPP3、LT-HSC、ST-HSC等干祖细胞亚群，以及B、T细胞、粒细胞和单核细胞等成熟细胞的数量。
体外共培养实验
验证Dlc1缺陷的骨髓内皮细胞在支持造血细胞扩增和分化方面的功能损害
利用BMEC-Akt细胞系，通过shRNA敲低Dlc1，与从mTmG小鼠中分选的LSK细胞共培养4周，每周收集非贴壁细胞进行流式细胞术分析，检测造血细胞产量。
细胞粘附实验
评估Dlc1缺陷骨髓内皮细胞对32D髓母细胞粘附性的影响
将32D细胞标记荧光后，与shCtrl或shDlc1处理的BMEC单层共孵育15或60分钟，洗涤后测量荧光强度，评估粘附细胞比例。
细胞因子谱分析
评估内皮Dlc1缺失对血清中细胞因子、趋化因子和粘附分子水平的影响
收集对照和Dlc1EC-KO小鼠血清，利用抗体芯片检测62种蛋白质的表达水平，并通过ImageJ定量。
单细胞RNA测序分析
揭示Dlc1缺陷骨髓内皮细胞的转录组变化以及对造血细胞的影响
从Dlc1EC-KO和对照小鼠中分选CD45⁻CD31⁺ZsGreen⁺内皮细胞和LSK细胞，使用10x Genomics平台进行单细胞RNA测序，并对数据进行无监督聚类、细胞类型注释和差异表达分析。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 胚胎血管分析 | CD34（抗体） | Abcam | ab81289 |
| 流式细胞术 | 谱系去除试剂盒 | BioLegend | 480004 |
| 骨髓内皮细胞培养 | DMEM/F-12培养基 | Millipore Sigma | -- |
| 内皮细胞补充物 | Millipore Sigma | E2759 | |
| 体外共培养 | StemSpan培养基 | STEMCELL Technologies | 09605 |
| 小鼠SCF（重组蛋白） | PeproTech | 250-03 | |
| 细胞粘附实验 | Vybrant CFDA SE细胞追踪染料 | Invitrogen | -- |
| 细胞因子检测 | 62种蛋白质抗体芯片 | Abcam | ab133995 |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 小鼠模型构建 | Cre品系（Cdh5-Cre或Cdh5-CreERT2）、Dlc1floxed等位基因、报告基因（ZsGreen或mTmG）、他莫昔芬剂量和给药途径 阅读提示：参见Materials and Methods: Mice and tamoxifen treatment |
| 胚胎分析 | 胚龄（E11.5、E13.5）、他莫昔芬诱导时间（E8.5-E10.5）、固定方法（4% PFA）、切片类型和厚度（石蜡5µm、冷冻10µm） 阅读提示：参见Materials and Methods: Embryo and tissue analyses |
| 骨髓血管成像 | 小鼠年龄（3-4周龄）、他莫昔芬处理方案、分析时间（4周后）、组织清除方法（EZ Clear）、成像设备（Zeiss LSM 880或Nikon SoRa） 阅读提示：参见Materials and Methods: Embryo and tissue analyses 和 Results 图3 |
| 流式细胞术 | 骨髓细胞分离方法、谱系去除试剂盒（BioLegend #480004）、内皮细胞富集策略、造血祖细胞亚群定义、流式细胞仪型号 阅读提示：参见Materials and Methods: Flow cytometry and cell sorting 和 Results 图4 |
| 骨髓内皮细胞培养和shRNA敲低 | BMEC-Akt细胞系来源和培养条件、shRNA序列（TRCN系列）、慢病毒包装和感染条件、嘌呤霉素筛选浓度（3 µg/ml） 阅读提示：参见Materials and Methods: Bone marrow EC culture and Dlc1 silencing |
| 共培养实验 | LSK细胞来源（mTmG小鼠）、种植密度、共培养培养基（StemSpan + SCF）、培养时间（28天）、每周收集和分析方案 阅读提示：参见Materials and Methods: Ex vivo ECs-HSPC co-culture 和 Results 图4 |
| 细胞粘附实验 | 32D细胞株、TNFα预处理浓度和时间、荧光标记方法、粘附时间（15和60分钟）、洗涤和检测方法 阅读提示：参见Results 图4J |
| 细胞因子谱分析 | 血清采集和处理、抗体芯片型号（Abcam ab133995）、样品稀释倍数、孵育和显色方法 阅读提示：参见Results 图4K |
| 单细胞RNA测序 | 细胞分选门控策略（CD45⁻CD31⁺ZsGreen⁺、LSK）、10x Genomics版本、测序平台（Illumina NextSeq 2000）、分析工具（Cell Ranger v9.0, Scanpy, CellChat） 阅读提示：参见Materials and Methods: Single-cell RNA-seq |