CRISPR筛选鉴定嘌呤代谢与NUDT5相关性
筛选与CRL抑制相关的代谢基因，发现嘌呤合成相关基因和NUDT5对MLN4924敏感性的影响。
用靶向约3000个代谢酶和转运蛋白的sgRNA文库感染U2OS细胞，经MLN4924处理后分析sgRNA丰度变化。
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代谢物胶水作为嘌呤感应和化疗反应的一种手段
Metabolite glues as a means of purine sensing and chemotherapeutic response
实验完整度
高结合CRISPR筛选、蛋白质互作验证、冷冻电镜结构解析、体外酶活与同位素示踪等多层级实验，并进行功能与机制验证。
主要模型
U2OS细胞系 HEK293T细胞系及其ΔNUDT5衍生株 急性淋巴细胞白血病细胞系MOLT4、Jurkat、NALM6 重组PPAT–NUDT5蛋白复合物
重点核对
U2OS细胞CRISPR筛选中MLN4924处理浓度150 nM，筛选时长24天 HEK293T细胞中PPAT–NUDT5内源复合物形成，以及MTX、6-MP处理浓度和时间 体外PPAT活性测定中PRPP浓度1 mM或0.25 mM，NUDT5浓度10 μM，PPAT浓度50 nM 同位素示踪中[15N-酰胺]-谷氨酰胺标记浓度2 mM，标记时长3小时 细胞活力测定中6-meTIMP处理浓度0-25 μM，处理72小时
摘要
分子胶水稳定弱相互作用以赋予复合物新功能。尽管分子胶水已在植物信号传导中被描述并作为人类治疗药物，但目前尚不清楚这种方式是否在人类细胞中提供内源性调控。在这里，我们显示嘌呤核苷酸是分子胶水，将嘌呤生物合成中的限速酶——磷酸核糖焦磷酸酰胺转移酶（PPAT）——与其抑制剂NUDT5连接起来。这一机制使细胞能够感知嘌呤水平并建立对其合成的必要反馈控制。我们将这类分子称为代谢物胶水。自20世纪50年代以来在临床上使用的硫嘌呤化疗药物，胶合同一复合物，但采用不同的取向以增强功能。与大多数已知胶水不同，PPAT–NUDT5代谢物胶水口袋能够适应显著的化合物改变，从而实现更高的胶水效力和改善的靶向活性。因此，我们将内源性代谢物胶水确定为一种营养感应模式，可被利用于治疗获益。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- 嘌呤核苷酸是否作为内源性分子胶水调控嘌呤从头合成，以及这种机制能否被硫嘌呤化疗药物利用并优化。
- 核心机制
- 嘌呤核苷酸（如AMP）作为代谢物胶水，将PPAT与其抑制剂NUDT5连接，稳定PPAT–NUDT5复合物，从而反馈抑制嘌呤从头合成；硫嘌呤代谢物（如6-meTIMP）作为更强效的胶水，通过同一口袋抑制PPAT。
- 主要证据
- 冷冻电镜结构解析了PPAT–NUDT5-AMP、6-meTIMP和6-benzylTIMP复合物；体外PPAT活性测定显示AMP或NUDT5单独抑制较弱，而两者结合协同抑制增强约50倍；细胞同位素示踪显示NUDT5 L217A/K218A突变增强嘌呤从头合成。
- 研究意义
- 确定了内源性代谢物胶水作为营养感应模式，并指出代谢物胶水口袋的构象灵活性可用于改进硫嘌呤类化疗药物的效力与靶向活性。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
验证NUDT5与PPAT相互作用
确认NUDT5与PPAT形成复合物，并验证相互作用的结构基础。
通过Flag免疫沉淀和质谱鉴定NUDT5互作蛋白；用AlphaFold建模和突变体验证关键残基。
解析PPAT–NUDT5复合物结构
揭示嘌呤核苷酸如何通过分子胶水机制连接PPAT与NUDT5。
纯化PPAT–NUDT5复合物，在AMP、6-meTIMP或6-benzylTIMP存在下进行冷冻电镜结构解析。
体外验证代谢物胶水功能
检测嘌呤核苷酸和硫嘌呤代谢物对PPAT酶活性和复合物稳定性的影响。
测定PPAT活性，比较AMP、6-meTIMP等存在或不存在NUDT5时的抑制效果；用AlphaLisa和质谱法检测复合物组装和稳定性。
细胞内验证嘌呤感应和硫嘌呤效应
验证代谢物胶水机制在细胞水平上调控嘌呤从头合成，并影响硫嘌呤化疗敏感性。
使用内源NUDT5突变细胞系，检测PPAT–NUDT5复合物动态变化、嘌呤从头合成速率（同位素示踪）和细胞存活。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 细胞培养 | 含Glutamax的DMEM培养基 | Gibco | 10566016 |
| 含谷氨酰胺的RPMI-1640培养基 | Gibco | 11875093 | |
| 胎牛血清 | VWR | 89510-186 | |
| 青霉素-链霉素 | Gibco | 15140122 | |
| 透析胎牛血清 | Cytiva | SH30079.02 | |
| 药物处理 | Pevonedistat (MLN4924) | MedChemExpress | HY-70062 |
| 甲氨蝶呤 | MedChemExpress | HY-14519 | |
| 洛美曲索 | MedChemExpress | HY-14521 | |
| 布喹那 | MedChemExpress | HY-108325 | |
| 雷帕霉素 | Adooq Biosciences | A10782 | |
| 6-巯基嘌呤 | Adooq Biosciences | A15898 | |
| 6-硫代鸟嘌呤 | Thermo Fisher Scientific | B21280.03 | |
| 6-硫代肌苷-5'-单磷酸 | Jena Biosciences | NU-1148 | |
| 6-甲基硫代肌苷-5'-单磷酸 | Jena Biosciences | NU-1226 | |
| 6-甲基硫代鸟苷-5'-单磷酸 | Jena Biosciences | NU-1128 | |
| 6-苄基硫代肌苷-5'-单磷酸 | WuXi | custom synthesis | |
| 6-乙基硫代肌苷-5'-单磷酸 | WuXi | custom synthesis | |
| 星形孢菌素 | Selleckchem | AM-2282 | |
| 酶活测定 | 磷酸核糖焦磷酸 | Sigma-Aldrich | P8296 |
| L-谷氨酰胺 | Sigma-Aldrich | G8540 | |
| 腺苷-5'-单磷酸 | Sigma-Aldrich | 01930 | |
| 肌苷-5'-单磷酸 | MedChemExpress | HY-W010759 | |
| 鸟苷-5'-单磷酸 | Sigma-Aldrich | G8377 | |
| AICA核糖核苷酸 | Cayman Chemicals | 33907 | |
| 细胞培养 | 腺嘌呤 | Thermo Fisher Scientific | A17622.14 |
| 药物处理 | 次黄嘌呤 | MedChemExpress | HY-N0091 |
| 蛋白纯化 | Strep-Tactin XT 4Flow 树脂 | IBA | 2-5010-010 |
| Flag-M2 琼脂糖珠 | Millipore | A2220 | |
| 免疫沉淀 | 苯并嘧啶酶 | Millipore | 70746 |
| cOmplete蛋白酶抑制剂混合物 | Roche | 11873580001 | |
| PhosStop磷酸酶抑制剂 | Roche | 4906845001 | |
| 蛋白纯化 | 生物素 | IBA | 2-1016-005 |
| BioLock 试剂 | IBA | 2-0205-050 | |
| 3xFlag 肽 | Sigma-Aldrich | F4799 | |
| 抗体 | 抗PPAT抗体 | ProteinTech | 15401-1-AP |
| 抗NUDT5抗体 | ProteinTech | 27004-1-AP | |
| 抗Flag抗体 | Sigma | F1804 | |
| 抗Vinculin抗体 | CST | 4650 | |
| 抗α微管蛋白抗体 | Calbiochem | CP06 | |
| 抗V5抗体 | CST | D3H8Q | |
| 抗HA抗体 | CST | C29F4 | |
| 蛋白纯化 | HisTrap crude FF 柱 | Cytiva | 17525501 |
| HiLoad Superdex 75 制备级SEC柱 | Cytiva | 28989333 | |
| Superose 6 10/300 increase SEC柱 | Cytiva | 29091596 | |
| Zeba 脱盐柱 | Thermo Fisher Scientific | 89882 | |
| Amicon 浓缩器 | Millipore | UFC9050 | |
| 蛋白表达 | 异丙基硫代半乳糖苷 | 文中未明确说明 | -- |
| LOBSTR-BL21(DE3)-RIL细胞 | Vector Laboratories | NC1789768 | |
| 转染 | Trans-IT LT1 转染试剂 | Mirus | MIR 2304 |
| 细胞培养 | 聚凝胺 | 文中未明确说明 | -- |
| CRISPR编辑 | Cas9-NLS蛋白 | UC Berkeley MacroLab | -- |
| 基因敲除试剂盒v.2 | Synthego | -- | |
| Alt-R HDR ssODN供体 | IDT | -- | |
| HDR增强子v.2 | IDT | -- | |
| 转染 | Lonza SF 溶液 | Lonza | V4XC-2032 |
| Lonza SE 溶液 | Lonza | V4XC-1032 | |
| Lonza 4D 核转染仪X单元 | Lonza | -- | |
| 流式细胞术 | BD LSRFortessa 流式细胞仪 | BD | -- |
| 细胞活力检测 | CellTiter Glo 试剂 | Promega | G7570 |
| CellTiter Blue 试剂 | Promega | G8080 | |
| 细胞成像 | Incucyte S3 显微镜 | Sartorius | -- |
| 蛋白互作检测 | AlphaLisa 微珠 | Revvity | 6760002S |
| 抗HA受体微珠 | Revvity | AL170C | |
| 质粒构建 | pLentiCRISPR-V2载体 | 文中未明确说明 | -- |
| pLVX-IRES-嘌呤霉素载体 | 文中未明确说明 | -- | |
| pLVX-IRES-杀稻瘟菌素载体 | 文中未明确说明 | -- | |
| 蛋白表达 | Expi293培养基 | Gibco | A1435101 |
| 基因组DNA提取 | QIAamp DNA血液Maxi试剂盒 | QIAGEN | 51192 |
| PCR | ExTaq DNA聚合酶 | Takara | RR001 |
| 质谱 | SeQuant ZIC-pHILIC 色谱柱 | Millipore-Sigma | 1.50460.0001 |
| Agilent 1260 Infinity 高效液相色谱 | Agilent | -- | |
| Agilent 6430 三重四极杆质谱 | Agilent | -- | |
| Orbitrap Exploris 240 质谱仪 | Thermo Fisher Scientific | -- | |
| Vanquish 超高效液相色谱系统 | Thermo Fisher Scientific | -- | |
| XBridge 酰胺色谱柱 | Waters | 186004860 | |
| TimsTOF 2 pro 混合质谱仪 | Bruker | -- | |
| Evosep One 纳升液相系统 | Evosep | -- | |
| PepSep 色谱柱 | Bruker | -- | |
| C18 脱盐柱 | Thermo Fisher Scientific | PI-87782 | |
| RapiGest SF 试剂 | Waters | 186008090 | |
| 胰蛋白酶 | 文中未明确说明 | -- | |
| TCEP | 文中未明确说明 | -- | |
| 蛋白互作检测 | Refeyn 质谱光度计TwoMP | Refeyn | -- |
| MassFerence P1标准品 | Refeyn | MP-CON-41033 | |
| 冷冻电镜 | Titan Krios G3i 显微镜 | Thermo Fisher Scientific | -- |
| BIO Quantum 能量过滤器 | Thermo Fisher Scientific | -- | |
| Gatan K3 直接电子探测器 | Gatan | -- | |
| Quantifoil R1.2/1.3 微栅 | 文中未明确说明 | -- | |
| 氟化辛基麦芽糖苷 | Anatrace | O310F | |
| Mark IV Vitrobot 冷冻制备仪 | Thermo Fisher Scientific | -- | |
| 代谢组学 | Cambridge Isotope Laboratories [15N-酰胺]-L-谷氨酰胺 | Cambridge Isotope Laboratories | NLM-557 |
| 13C6-葡萄糖-6-磷酸 | 文中未明确说明 | -- | |
| 13C1-果糖-1,6-二磷酸 | 文中未明确说明 | -- | |
| 乙酸铵 | 文中未明确说明 | -- | |
| 碳酸氢铵 | 文中未明确说明 | -- | |
| 蛋白质谱 | 13C-15N 氨基酸 | Cambridge Isotope Laboratories | MSK-A2-1.2 |
| 生化检测 | 谷氨酸-Glo试剂 | Promega | J7021 |
| 蛋白质浓度测定 | Pierce 660nm 蛋白质测定试剂 | Thermo Fisher Scientific | 22660 |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| CRISPR筛选 | U2OS细胞；MLN4924处理浓度150 nM；筛选时长24天；sgRNA文库覆盖度 阅读提示：Methods中“Metabolism-focused CRISPR screen” |
| 免疫沉淀 | 细胞系HEK293T；裂解缓冲液成分；Flag-M2琼脂糖珠用量；洗涤步骤 阅读提示：Methods中“Immunoprecipitation” |
| 冷冻电镜结构解析 | 蛋白浓度；核苷酸浓度；网格类型；冷冻条件；数据收集参数 阅读提示：Methods中“Cryo-EM sample preparation, data collection and analysis” |
| PPAT活性测定 | PPAT浓度50 nM；NUDT5浓度10 μM；PRPP浓度1 mM或0.25 mM；反应时间8分钟；检测方法Glutamate-Glo 阅读提示：Methods中“PPAT activity assay” |
| 同位素示踪 | 细胞密度；[15N-酰胺]-谷氨酰胺浓度2 mM；标记时长3小时；内标使用13C6-葡萄糖-6-磷酸 阅读提示：Methods中“Isotope tracing experiments” |