样本收集与处理
获取并处理来自人肺和淋巴结的T细胞以进行下游分析。
从40例接受手术的肺癌患者中收集未受累的肺组织和肺引流淋巴结，以及匹配的外周血，同时从独立队列收集PBMC。样品经解冻、酶消化并分选CD3+ T细胞或CD4+和CD8+ T细胞。
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人肺维持针对多种病原体的组织驻留记忆T细胞
Human lungs maintain tissue-resident memory T cells against a broad spectrum of pathogens
实验完整度
高包含横断面和纵向人体组织样本，结合单细胞测序、TCR组库分析和功能验证，覆盖多个独立证据层级。
主要模型
人肺组织样本（横断面和纵向） 人肺引流淋巴结（LLN） 外周血单核细胞（PBMC）
重点核对
是否使用TCR引导的整合策略进行病原体特异性归属 是否包含功能验证（如TCR转导的报告细胞系） 是否进行纵向样本分析以确认TRM持久性 是否设置适当的对照组以排除旁观者激活
摘要
肺组织驻留记忆T（TRM）细胞对前线免疫至关重要，但在小鼠肺中会迅速减少。这一模式是否适用于人类尚不清楚。我们在此展示了来自人肺的T细胞的全面分析，描述了针对多种病原体的人肺TRM细胞的普遍性和特性。我们利用T细胞受体引导的方法，整合单细胞转录组学与配对T细胞受体库分析，绘制了来自40个个体的超过87,000个肺T细胞的病原体特异性，其中大多数人携带针对多种病原体的TRM细胞。我们证实，大部分肺TRM克隆在肺中可持续数月到数年。因此，与小鼠相比，人肺保留了一个稳定且多样的病原体特异性TRM细胞库，提示增强这些反应的策略可能对严重的肺部感染提供持久保护。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- 探讨人肺中TRM细胞是否能维持长期、多样化的病原体特异性反应，并评估小鼠模型中TRM细胞快速丢失的范式是否适用于人类。
- 核心机制
- 人肺作为病原体特异性TRM细胞的长期储存库，其维持不依赖于肺引流淋巴结或血液循环的持续补充，且与供体内在因素相关，而非近期感染或TCR信号驱动。
- 主要证据
- 基于对40例个体超过87,000个肺T细胞的单细胞转录组和配对TCR图谱分析，以及纵向样本中TRM克隆的持续存在，结合体外功能验证和公开数据库比对。
- 研究意义
- 研究表明增强肺TRM反应的策略可能提供对严重肺部感染的持久保护，并强调在将小鼠模型的研究结果外推到人类时需要谨慎。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
单细胞测序与TCR图谱分析
获取单细胞的转录组和配对TCR序列，以分析T细胞亚群和克隆扩增。
使用10x Genomics平台对分选的T细胞进行单细胞RNA测序和TCR测序，生成超过600,000个肺T细胞和330,000个LLN T细胞的转录组和TCR数据。
T细胞亚群注释与克隆分析
注释T细胞亚群并评估克隆扩增和多样性。
通过无监督聚类和表型标记将T细胞分为不同亚群，如TRM、TCM、TEM等，并计算克隆扩增频率和Gini指数。
病原体特异性TCR的构建与验证
构建病原体特异性TCR库，并验证其病原体识别能力。
通过体外增殖实验（PBMC刺激）和ARTE实验获得病原体反应性TCR，并在Jurkat报告细胞系中表达验证其特异性激活。
病原体特异性归属
利用TCR将肺T细胞归类到特定病原体。
采用供体匹配、参考匹配和UCM三种策略，整合后分配病原体特异性。
表型关联和纵向分析
评估病原体特异性TRM细胞的表型特征和持久性。
分析病原体特异性TRM细胞的表型分布和克隆共享，通过纵向样本分析验证TRM细胞的长期维持。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
验证分子表达变化
验证免疫效应
数据分析与统计
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 细胞分离和单细胞测序 | FACSAria Fusion细胞分选仪 | Becton Dickinson | -- |
| 组织消化 | gentleMACS C管 | Miltenyi Biotec | 130-096-334 |
| DNase I | Sigma | D4527-200K | |
| Liberase | Sigma | 5401127001 | |
| OctoDissociator | Miltenyi Biotec | -- | |
| 细胞分离 | MACS缓冲液 | -- | -- |
| 人FcR阻断剂 | Miltenyi | 130059901 | |
| Cell-hashtag TotalSeq-C抗体 | -- | -- | |
| DAPI | -- | -- | |
| 单细胞测序 | 10x Genomics平台 | 10x Genomics | -- |
| 测序 | Illumina NovaSeq 6000 | Illumina | S10OD025052 |
| Illumina X Plus | Illumina | S10 OD026929 | |
| 细胞培养 | RPMI培养基 | -- | -- |
| 胎牛血清 | -- | -- | |
| 二甲基亚砜 | -- | -- | |
| 功能验证 | Jurkat报告细胞系 | -- | -- |
| NFAT-GFP报告基因 | -- | -- | |
| 肽刺激 | 肽巨池 | -- | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 样本收集 | 样本来源、样本类型（肺组织、LLN、PBMC）、样本量、供体数量 阅读提示：Methods: Human samples |
| 单细胞测序 | 测序平台、版本、质量控制阈值、数据处理流程 阅读提示：Methods: Single-cell transcriptomic analysis |
| TCR图谱分析 | TCR序列定义、克隆型定义 阅读提示：Methods: Single-cell TCR sequence data analysis |
| 病原体特异性归属 | 参考TCR数据集、匹配策略、冲突解决标准 阅读提示：Methods: Individual strategies to assign pathogen specificities |
| 纵向分析 | 抽样时间点、样本间隔、配对样本 阅读提示：Methods: Human samples; Extended Data Fig. 8 |