队列建立与样本采集
收集并特征化结核病家庭接触者和活动性结核病患者的临床及影像学数据，获取BAL样本。
招募153名家庭接触者，其中11名进展为结核病；对66名接触者进行支气管镜BAL采样，同时采集30名活动性结核病患者的BAL。进行PET-CT、IGRA检测和临床随访。
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近期人类结核病家庭接触者中保护与疾病进展的气道免疫特征
Airway immune signatures of protection and disease progression in recent human tuberculosis household contacts
实验完整度
高研究包含人类队列样本（BAL）、scRNA-seq、bulk RNA-seq、流式细胞术、蛋白质组学，并在非人灵长类和小鼠模型中进行了跨物种验证，且包含功能验证（IFNAR阻断）。
主要模型
人类结核病家庭接触者队列 活动性结核病患者队列 非人灵长类（猕猴）结核病肉芽肿模型 结核分枝杆菌感染的结核易感小鼠模型
重点核对
研究对象为近期结核病家庭接触者，分为进展者（11例）和非进展者（55例），非进展者进一步按IGRA和PET-CT状态分组 BAL样本采集时间点：基线、随访及进展时（若适用） 中性粒细胞高与低分组以BAL CD45+白细胞中中性粒细胞比例≥15%为界 scRNA-seq数据经CellBender去除环境RNA，使用Harmony整合，通过CellTypist注释细胞类型 差异表达分析使用DESeq2（Wald检验），调整性别，显著阈值FC≥1.5且BH校正P<0.05
摘要
决定感染结核分枝杆菌的个体是保持健康还是进展为活动性结核病（TB）的局部免疫因素尚未明确。在此，我们以单细胞分辨率探究了经正电子发射断层和计算机断层扫描（PET-CT）特征化的近期结核病家庭接触者的支气管肺泡灌洗液（BAL）中的气道免疫反应，这些接触者要么控制了感染，要么进展为结核病，此外还包括诊断时的活动性结核病患者。单细胞RNA测序揭示了活动性结核病患者和结核病进展者BAL中的I型干扰素依赖和干扰素非依赖的中性粒细胞特征。我们报告了气道中性粒细胞与T细胞之间的负相关关系，在进展者和具有中性粒细胞主导的气道特征的活动性结核病患者中，T细胞显示出耗竭、细胞毒性和细胞死亡的特征。相反，我们在未进展接触者中鉴定了以调控、静止和干细胞样特征相关基因主导的T细胞保护特征。我们在结核病接触者早期人类气道反应中的发现揭示了可能决定感染结局的基因、通路和细胞状态，并为制定有效的宿主导向疗法和疫苗策略提供信息。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- 决定结核分枝杆菌感染后是保持健康还是进展为活动性结核病的早期局部免疫因素是什么？
- 核心机制
- 气道中性粒细胞积累伴随T细胞耗竭、细胞毒性和细胞死亡，而控制感染的接触者中T细胞保持静止和干细胞样状态，从而维持保护性免疫。
- 主要证据
- 通过对BAL进行单细胞RNA测序，发现活动性结核病患者和进展者中中性粒细胞（C2和C3群）增加，T细胞显示耗竭等特征；非进展者中T细胞富含调控、静止和干细胞样基因（如FOXO1、BTG1、IL7R、LEF1）。
- 研究意义
- 这些发现为宿主导向疗法和疫苗开发提供了潜在靶点和保护性相关因素。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
单细胞转录组分析
鉴定BAL中免疫细胞的组成和转录状态。
对894,159个BAL白细胞进行scRNA-seq，鉴定出巨噬细胞、单核细胞、树突状细胞、中性粒细胞和T/NK细胞等簇。
差异丰度和基因表达分析
比较不同临床结局（非进展、进展、活动性结核病）之间的细胞丰度和基因表达差异。
使用Milo进行差异丰度分析，使用PyDESeq2进行伪bulk差异表达分析，鉴定中性粒细胞、巨噬细胞和T细胞中的差异表达基因。
中性粒细胞亚型特征分析
定义中性粒细胞的不同转录状态及其与疾病严重性的关联。
鉴定出两个中性粒细胞簇C2和C3，C2高表达IL1B和I型干扰素诱导基因，C3表达CXCR4和趋化因子。
跨物种验证
验证人类气道中发现的免疫特征是否在非人灵长类和小鼠结核病模型中重现。
将人类C2中性粒细胞特征和巨噬细胞失败免疫特征映射到NHP肉芽肿scRNA-seq数据和结核易感小鼠肺数据中，评估富集情况。
T细胞表型与功能分析
评估中性粒细胞积累对T细胞表型的影响，并鉴定非进展者中的保护性T细胞特征。
通过流式细胞术分析T细胞表面标志物，通过scRNA-seq差异表达分析鉴定非进展者T细胞亚群中高表达的基因，并与已发表的NHP保护性T细胞特征进行比较。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 支气管肺泡灌洗（BAL）处理 | RPMI 1640培养基 | Thermo Fisher Scientific | -- |
| 红细胞裂解 | ACK裂解缓冲液 | Thermo Fisher Scientific | -- |
| 细胞计数 | FastRead一次性血细胞计数器 | Immune Systems | -- |
| RNA提取 | TRI试剂 | Sigma-Aldrich | -- |
| DirectZol RNA微量制备试剂盒 | Zymo Technologies | -- | |
| Bulk RNA-seq文库构建 | RNA文库制备试剂盒（含Polaris核糖体RNA去除） | Watchmaker Genomics | -- |
| scRNA-seq | Chromium Next GEM单细胞固定RNA样品制备试剂盒 | 10X Genomics | -- |
| Chromium固定RNA多路复用样品分析试剂盒 | 10X Genomics | -- | |
| scRNA-seq固定 | 超纯牛血清白蛋白 | Thermo Fisher Scientific | -- |
| 甲醛 | -- | -- | |
| 流式细胞术 | 可固定蓝色活力染料 | Thermo Fisher Scientific | -- |
| 人Fc阻断剂 | BD Biosciences | -- | |
| True-Stain单核细胞阻断剂 | BioLegend | -- | |
| HLA-DR-BV785 | BioLegend | AB_2563461 | |
| CD206-APC/Cy7 | BioLegend | AB_2144930 | |
| CD45-PERCP/Cy5.5 | BioLegend | AB_893338 | |
| CD16-AF700 | BioLegend | AB_2278418 | |
| CD11c-PE/Cy7 | BioLegend | AB_389351 | |
| CD14-PE | BioLegend | AB_314188 | |
| CD15-FITC | BioLegend | AB_314196 | |
| CD3-BV510 | BioLegend | AB_2561943 | |
| CD56-APC | BioLegend | AB_2563913 | |
| CD19-BV650 | BioLegend | AB_2562097 | |
| CD4-PE/Dazzle595 | BioLegend | AB_2565847 | |
| CD8a-BUV737 | BD Biosciences | AB_2870085 | |
| Siglec 8-BV711 | BD Biosciences | AB_2872332 | |
| T细胞表型分析 | CCR7-BV711 | BioLegend | AB_2563865 |
| CCR6-PE/Cy7 | BioLegend | AB_10916518 | |
| CXCR3-APC | BioLegend | AB_10983064 | |
| PD-1-BV650 | BioLegend | AB_2566362 | |
| HLA-DR-FITC | BioLegend | AB_314682 | |
| CD69-APC/Cy7 | BioLegend | AB_314849 | |
| CD45RA-PE | BioLegend | AB_314412 | |
| CD56-BV785 | BioLegend | AB_2566059 | |
| CD103-PE/Dazzle594 | BioLegend | AB_2716189 | |
| CD4-AF700 | BioLegend | AB_571943 | |
| CD4-PE/Cy7 | BioLegend | AB_571959 | |
| 流式细胞术 | X20分析仪 | BD Biosciences | -- |
| FACSDiva v9.2软件 | BD Biosciences | -- | |
| FlowJo v10软件 | BD Biosciences | -- | |
| Luminex蛋白检测 | Luminex Discovery检测试剂盒 | Bio-Techne | -- |
| Bio-Plex 200系统 | Bio-Rad | -- | |
| Ultrafree 0.22微米离心过滤器 | Sigma-Aldrich | -- | |
| scRNA-seq | Cell Ranger v7.0.1 | 10X Genomics | -- |
| scRNA-seq分析 | CellBender v0.3.2 | -- | -- |
| Scanpy v1.11.4 | -- | -- | |
| Harmony | -- | -- | |
| CellTypist | -- | -- | |
| Scrublet | -- | -- | |
| 数据分析 | Milo | -- | -- |
| Pertpy v1.0.2 | -- | -- | |
| PyDESeq2 v0.5.2 | -- | -- | |
| decoupler v2.1.1 | -- | -- | |
| CellChat v1.1.3 | -- | -- | |
| DESeq2 v1.42.1 | -- | -- | |
| GSEA.py | -- | -- | |
| Prism v10.6.0 | GraphPad | -- | |
| pheatmap v1.0.13 | -- | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 队列招募与分组 | 家庭接触者定义为近期接触，进展者定义依赖临床决策（WHO标准）或PET-CT进展，非进展者按IGRA和PET-CT状态分组（IGRA- PET-CT-，IGRA+ PET-CT-，IGRA+ LN PET-CT+，IGRA+ lung PET-CT+） 阅读提示：Methods: Participant recruitment and clinical study design; Fig. 1; Extended Data Fig. 1 |
| BAL采集与处理 | BAL回收量、转运时间、细胞活力中位数（82.6%），排除标准（吸烟、感染等） 阅读提示：Methods: Bronchoscopy; BAL processing |
| scRNA-seq条件 | 固定方法、批次合并方式、细胞数、测序深度，分析参数（细胞过滤阈值、聚类分辨率等） 阅读提示：Methods: scRNA-seq; scRNA-seq analysis |
| 中性粒细胞亚型分类 | 中性粒细胞高/低分组阈值（≥15%中性粒细胞），C2和C3簇的鉴定标志基因 阅读提示：Results: Type I IFN-dependent and -independent neutrophil states...; Methods: scRNA-seq analysis |
| 蛋白质检测 | Luminex检测的analyte列表和稀释倍数（至少1:1），有效检测限定义 阅读提示：Methods: Luminex protein assays |