Structural basis of liver de-targeting and neuronal tropism of CNS-targeted AAV capsids
包含冷冻电镜结构解析、BLI亲和力测定、pull-down、细胞感染实验及小鼠体内转导验证等多个独立证据层级，并进行了机制验证。
HEK293T细胞（体外感染实验） C57BL/6J小鼠（体内转导实验） AAV衣壳变体（CAP-B10、eB.24、AAV9-B10等）
冷冻电镜结构分辨率：CAP-B10 2.22 Å，CAP-B10-PKD2 2.20 Å，AAV9-X1 3.09 Å，AAV9-X1.1 2.51 Å，AAV9-X1.1-PKD2 2.18 Å，AAV9-B10 3.05 Å，eB.24 2.05 Å BLI亲和力测定：AAV9 Kd 11 μM，PHP.eB 14 μM，CAP-B10 61 μM，AAV9-X1 6 μM，AAV9-X1.1 19 μM，eB.24 24 μM，AAV9-B10 47 μM，重复3次 小鼠体内转导：C57BL/6J雄性小鼠，6-8周龄，AAV剂量1×10^11 vg/只，n=3（AAV9、AAV9-B10）或n=6（PHP.eB、eB.24、CAP-B10），注射后3周分析 细胞感染实验：HEK293T细胞，LY6A转染或不转染，AAV处理浓度1×10^9或5×10^9 vg/孔 Pull-down实验：AAVR-PKD2（100-200 pmol）、LY6A（30-60 pmol）、D-半乳糖树脂
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
确定CAP-B10、AAV9-X1、AAV9-X1.1、AAV9-B10和eB.24的衣壳结构及其与AAVR-PKD2复合物的结构，以揭示VR-IV修饰对AAVR结合的影响。
对纯化的AAV衣壳（浓度1×10^12-1×10^13 vg/mL）进行冷冻电镜数据收集，使用300 kV Titan Krios或200 kV Talos Arctica显微镜，经CryoSPARC处理，以AAV9结构为模板构建模型，分辨率2.05-3.09 Å。
定量不同AAV衣壳与AAVR-PKD2的结合亲和力，验证VR-IV修饰对AAVR结合的影响。
使用生物层干涉法（BLI）测量AAV衣壳与AAVR-PKD2的平衡解离常数（Kd）。将生物素化的AAV9亲和配体固定在链霉亲和素生物传感器上，加载AAV衣壳，然后结合不同浓度的PKD2。
验证CAP-B10的VR-IV修饰是否影响与其他受体（LY6A、D-半乳糖）的结合，以确认其对AAVR的特异性。
进行pull-down实验，使用带有6xHis标签的AAVR-PKD2、His-Fc-LY6A或D-半乳糖树脂作为诱饵，与AAV衣壳共孵育，洗脱后通过SDS-PAGE和Western blot检测捕获的AAV量。
评估不同AAV衣壳在HEK293T细胞中的感染效率，验证AAVR亲和力对转导的影响，并测试LY6A是否补偿AAVR亲和力的降低。
HEK293T细胞培养于6孔板，转染LY6A表达质粒或对照，然后铺至96孔板，用AAV感染，24小时后成像并定量GFP阳性细胞。
评估不同AAV衣壳在小鼠体内的肝脏和脑转导情况，验证AAVR亲和力与肝脏去靶向和脑细胞类型向性的关系。
将包装eGFP的AAV（AAV9、AAV9-B10、PHP.eB、eB.24、CAP-B10）通过眶后注射给予C57BL/6J小鼠，注射后3周取材，免疫组化染色并定量GFP阳性细胞。
比较AAV9和AAV9-B10在不同器官的转导水平，以确定VR-IV修饰对非肝脏器官的影响。
通过免疫组化染色和数字微滴PCR（ddPCR）定量各器官（肝脏、胰腺、骨骼肌、心脏）的GFP表达或DNA拷贝数。
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 病毒生产 | 聚乙烯亚胺（PEI Max） | Polysciences | -- |
| 病毒纯化 | 碘克沙醇 | -- | -- |
| 病毒定量 | QX200数字微滴PCR系统 | Bio-Rad | 1863005 |
| 蛋白表达与纯化 | BL21 (DE3)-RIPL大肠杆菌 | -- | -- |
| 蛋白纯化 | Ni-NTA树脂 | Qiagen | -- |
| Superdex 200凝胶过滤柱 | Cytiva | -- | |
| 蛋白表达 | 直链淀粉树脂 | New England Biolabs | -- |
| 蛋白纯化 | Amicon浓缩管（10K） | Sigma-Millipore | -- |
| 冷冻电镜 | Quantifoil R 1.2/1.3 300目铜网 | -- | -- |
| Vitrobot Mark IV自动制样机 | FEI (Thermo Fisher) | -- | |
| Titan Krios透射电子显微镜 | Thermo Fisher | -- | |
| Talos Arctica透射电子显微镜 | Thermo Fisher | -- | |
| K3直接电子探测器 | Gatan | -- | |
| 生物层干涉法 | Octet SAX链霉亲和素包被生物传感器 | Sartorius | -- |
| CaptureSelect生物素化AAV9纳米抗体 | Thermo Fisher | -- | |
| Pull-down实验 | D-半乳糖琼脂糖树脂 | Thermo Fisher | 20372 |
| Western blot | 抗VP1/VP2/VP3抗体 | Arp | 03-61058 |
| 抗6xHis抗体 | Abcam | ab18184 | |
| 免疫组化 | 抗S100B抗体 | Abcam | ab52642 |
| F(ab')2驴抗兔Alexa Fluor 647 | Jackson ImmunoResearch | 711-606-152 | |
| 抗eGFP抗体 | Antibodiesinc | GFP-1020 | |
| F(ab')2驴抗鸡Alexa Fluor 647 | Jackson ImmunoResearch | 703-606-155 | |
| Hoechst 33342 | Thermo Fisher | H3570 | |
| NeuroTrace 640/660 | Thermo Fisher | N21483 | |
| 样品封片 | Prolong Diamond抗淬灭封片剂 | Thermo Fisher | P36965 |
| 成像分析 | Keyence BZ-X710荧光显微镜 | Keyence | -- |
| Zeiss LSM 880共聚焦显微镜 | Zeiss | -- | |
| 转盘共聚焦显微镜（Dragonfly） | Andor | -- | |
| sCMOS相机（Zyla） | Andor | -- | |
| ddPCR | Quick-DNA FFPE小提试剂盒 | Zymo Research | D3067 |
| SphI-HF内切酶 | New England Biolabs | R3182 | |
| SpeI-HF内切酶 | New England Biolabs | R3133 |
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 病毒生产 | HEK293T细胞培养条件、转染试剂及比例、纯化方法 阅读提示：Materials and Methods: Viral production |
| 冷冻电镜 | AAV浓度、网格类型、电流强度、处理时间、显微镜型号、像素大小、剂量范围 阅读提示：Materials and Methods: Cryo-EM sample preparation and collection |
| 亲和力测定 | PKD2浓度范围、传感器类型、运行缓冲液组成、再生条件 阅读提示：Materials and Methods: Biolayer interferometry |
| 体内转导 | 小鼠品系、年龄、性别、AAV剂量、注射方式、分析时间点 阅读提示：Materials and Methods: Retro-orbital injection and tissue preparation; Figure 4 legend |
| 免疫组化 | 组织切片厚度、封闭液、抗体浓度、孵育时间 阅读提示：Materials and Methods: Immunohistochemistry |
