miRNA表达谱分析
筛选在正常神经细胞中高表达而在肿瘤中低表达的miRNA，作为MRE设计的靶点。
通过数据库分析（dbDEMC和TissueAtlas）和RT-PCR检测不同细胞系中miR-219a-2-3p、miR-219a-5p、miR-129-5p和miR-4298的表达，包括肿瘤细胞系和非肿瘤细胞系，以及iPS来源的NPC细胞。
关于丁香通
公司信息
个人用户
企业机构
无忧采购 轻松科研
- 移动端
基因修饰的寨卡病毒作为microRNA敏感的溶瘤病毒治疗中枢神经系统肿瘤
Genetically modified ZIKA virus as a microRNA-sensitive oncolytic virus against central nervous system tumors
实验完整度
高包含体外细胞系溶瘤活性验证、正常细胞安全性验证、miRNA抑制机制验证、体内异种移植模型疗效与安全性验证等多个独立证据层级。
主要模型
人胚胎性CNS肿瘤细胞系（Daoy、ONS-76、CHLA06、USP07） 胶质母细胞瘤细胞系（U138-MG、LN-18、U251-MG） 非肿瘤细胞系（hCMEC、HMC3、NPC细胞） Balb/C Nude小鼠原位异种移植模型（USP07细胞）
重点核对
病毒株类型（oZIKV_2k、oZIKV_3′、野生型ZIKV） 感染复数（MOI）范围和细胞活力检测时间点（3或5天） 体内实验中肿瘤细胞注射数量（10^6 USP7细胞）及病毒给药剂量（2×10^3 PFU） 给药途径（颅内注射和腹腔注射）及给药次数（一次或三次）
摘要
在此，我们介绍一种针对中枢神经系统（CNS）肿瘤进行病毒治疗的首创性microRNA敏感溶瘤寨卡病毒（ZIKV）。所述方法产生了两种合成的修饰ZIKV株，它们在正常细胞（包括神经干细胞）中是安全的，同时保留了对肿瘤细胞的脑嗜性和溶瘤作用。microRNA敏感的ZIKV在两个不同的病毒位点引入基因修饰：首先在已确立的3'UTR区域，其次在ZIKV蛋白编码序列中，首次证明miRNA抑制系统可以在UTR RNA位点之外发挥功能。在脑室内和全身施用修饰ZIKV后，携带人类CNS肿瘤（包括转移性肿瘤生长）的小鼠完全肿瘤消退，证实了这种病毒疗法作为针对脑肿瘤的新型药物的前景——脑肿瘤是迫切需要有效先进疗法的高度致命疾病。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- 如何通过基因工程改造寨卡病毒（ZIKV），使其对正常细胞安全，同时保留对中枢神经系统肿瘤的溶瘤作用？
- 核心机制
- 在ZIKV基因组中插入miRNA响应元件（MRE），在正常细胞中高表达的miRNA（如miR-129-5p和miR-219a-2-3p）结合MRE导致病毒RNA降解，从而抑制病毒复制，而在肿瘤细胞中这些miRNA表达低，病毒得以选择性复制并发挥溶瘤作用。
- 主要证据
- 在细胞水平验证了MRE介导的病毒抑制机制；在体外证实oZIKV对多种肿瘤细胞系具有细胞毒性；在Balb/C Nude小鼠原位异种移植模型中，oZIKV_2k诱导肿瘤消退并提高生存率，且全身给药时优于野生型病毒。
- 研究意义
- 该研究开发了一种首创的microRNA敏感溶瘤ZIKV，为中枢神经系统肿瘤提供了一种潜在更安全的病毒疗法，并可能开辟系统性给药的途径。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
部分ZIKV构建体（PZC）的克隆与验证
在一个非复制型部分病毒模型中验证MRE介导的miRNA抑制机制。
构建了包含ZIKV部分序列和报告基因（GFP和Nluc）的PZC质粒，插入MRE序列，通过在Vero和CHLA06细胞中过表达相应miRNA后检测NanoLuc活性来评估抑制效果。
合成修饰ZIKV（oZIKV_2k和oZIKV_3′）的生成
基于巴西ZIKV株基因组合成产生两种miRNA敏感的溶瘤ZIKV。
在pCC1低拷贝质粒中合成ZIKV基因组，通过限制性克隆将MRE插入3'UTR（oZIKV_3′）或2k蛋白编码区（oZIKV_2k），体外转录RNA后电穿孔Vero细胞产生病毒，并通过RT-PCR和PFU测定病毒滴度。
oZIKV的miRNA抑制机制验证
确认过表达相应miRNA能抑制修饰病毒的溶瘤活性。
在CHLA06和Daoy细胞中先转染miRNA mimic，再感染oZIKV_3′或oZIKV_2k，5天后检测细胞活力，比较miRNA过表达与对照组。
体外溶瘤活性评估
评估修饰病毒在多种肿瘤细胞系上的细胞毒性作用。
用不同MOI（0.002至5）的oZIKV_2k、oZIKV_3′和野生型ZIKV感染一系列肿瘤细胞系，3天后检测细胞活力。
体外安全性评估
验证修饰病毒在非肿瘤细胞（包括神经干细胞）中的安全性。
用不同MOI的病毒感染非肿瘤细胞系（hCMEC、HMC3）和NPC神经球，检测细胞活力、病毒RNA复制、细胞凋亡和坏死，以及IFNβ表达。
体内抗肿瘤疗效和安全性评估
在异种移植小鼠模型中评估oZIKV_2k的溶瘤活性和安全性。
将USP07-luc细胞注射到免疫缺陷小鼠的侧脑室，建立颅内肿瘤模型，然后通过颅内或腹腔注射给予oZIKV_2k或野生型ZIKV，监测肿瘤生长（生物发光成像）和生存期，并进行组织学分析。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
验证分子表达变化
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 细胞培养 | DMEM/F12培养基 | Thermo Fisher Scientific | -- |
| N2添加剂 | Gibco | -- | |
| B27添加剂（不含维生素A） | Gibco | -- | |
| 表皮生长因子 | Gibco | -- | |
| 成纤维细胞生长因子 | Gibco | -- | |
| 基质胶 | Corning | -- | |
| Accutase消化液 | Thermo Fisher Scientific | -- | |
| Tryple Select消化液 | Thermo Fisher Scientific | -- | |
| Normocin抗菌剂 | InvivoGen | -- | |
| MycoAlert PLUS支原体检测试剂盒 | Lonza | LT07-710 | |
| miRNA表达检测 | mirVana miRNA提取试剂盒 | Invitrogen | -- |
| TaqMan Advanced miRNA检测试剂盒 | Applied Biosystems | -- | |
| TaqMan Fast Advanced预混液 | Applied Biosystems | -- | |
| RT-qPCR | QuantStudio 7 Flex实时荧光定量PCR系统 | Applied Biosystems | -- |
| NanoDrop分光光度计 | Thermo Fisher Scientific | -- | |
| miRNA调控 | mirVana miRNA模拟物 hsa-miR-129-5p | Thermo Fisher Scientific | -- |
| mirVana miRNA模拟物 hsa-miR-219a-2-3p | Thermo Fisher Scientific | -- | |
| mirVana miRNA模拟物阴性对照#1 | Thermo Fisher Scientific | -- | |
| 细胞转染 | Lipofectamine MessengerMAX转染试剂 | Invitrogen | -- |
| 分子克隆 | BsiWI限制性内切酶 | Thermo Fisher Scientific | -- |
| MluI限制性内切酶 | Thermo Fisher Scientific | -- | |
| NsiI限制性内切酶 | Thermo Fisher Scientific | -- | |
| T4 DNA连接酶 | Thermo Fisher Scientific | -- | |
| DH10B感受态细胞 | Invitrogen | -- | |
| GeneJET质粒小提试剂盒 | Thermo Fisher Scientific | -- | |
| Sanger测序 | -- | -- | |
| 体外转录 | MEGAscript T7转录试剂盒 | Ambion | -- |
| 细胞电穿孔 | GenePulserXcell电穿孔仪 | Bio-Rad | -- |
| 病毒生产 | Vero细胞 | ATCC | CCL-81 |
| 细胞活力检测 | CellTiter-Glo发光细胞活力检测试剂盒 | Promega | -- |
| 细胞死亡检测 | RealTime-Glo Annexin V凋亡和坏死检测试剂盒 | Promega | -- |
| 病毒RNA提取 | 病毒RNA小提试剂盒 | Qiagen | -- |
| 病毒RNA定量 | TaqMan Fast Virus 1-Step预混液 | Thermo Fisher Scientific | -- |
| 病毒滴度 | 琼脂糖 | Thermo Fisher Scientific | -- |
| qRT-PCR | RNeasy RNA提取试剂盒 | Qiagen | -- |
| SuperScript III逆转录酶 | Invitrogen | -- | |
| TaqMan基因表达检测试剂盒 | Applied Biosystems | -- | |
| 动物实验 | Balb/C裸鼠 | -- | -- |
| IVIS成像系统 | PerkinElmer | -- | |
| 组织病理学 | 抗ZIKV NS2抗体 | Genetex | GTX133308 |
| DeadEnd荧光TUNEL系统 | Promega | -- | |
| 共聚焦显微镜 | Zeiss | LSM 800 |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 细胞培养 | 细胞系来源、培养条件（培养基、添加剂、基质） 阅读提示：Materials and methods, Cell culture |
| miRNA表达检测 | RNA提取方法、RT-PCR条件、内参基因 阅读提示：Materials and methods, MiRNA expression profile |
| PZC构建 | 克隆位点、MRE序列、质粒构建方法 阅读提示：Materials and methods, Molecular clone design of ZIKV |
| 病毒生成 | 体外转录条件、电穿孔参数、细胞类型 阅读提示：Materials and methods, In vitro transcription and Cell transfection |
| 体外感染 | MOI、感染时间、细胞密度、检测时间点 阅读提示：Materials and methods, Cell viability assay、MiRNA modulation |
| 体内实验 | 小鼠品系、细胞注射数和途径、病毒剂量、给药途径和次数、麻醉和成像条件 阅读提示：Materials and methods, Mice and treatment groups、Wild-type ZIKV and oZIKV_2k treatments |
| 组织学分析 | 组织固定、切片厚度、抗体稀释、TUNEL检测步骤 阅读提示：Materials and methods, Histopathology |