全基因组筛选与验证
筛选与FOXM1相互作用并通过液-液相分离增强其转录活性的核内蛋白。
结合GSEA和PhaSePred预测，对5654个核内基因进行筛选，获得5个候选基因，并在HEK293T细胞中验证其与FOXM1共表达后凝聚体形成能力，最终确定ASPM-iII。
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ASPM通过液-液相分离介导FOXM1的核滞留促进肝细胞癌的进展
ASPM mediates nuclear entrapment of FOXM1 via liquid-liquid phase separation to promote progression of hepatocarcinoma
实验完整度
高包含体外细胞实验、体内异种移植瘤模型、患者样本分析以及ChIP-seq、Co-IP、免疫荧光等分子机制验证，层级完整。
主要模型
HCC细胞系SNU-739、HepG2、MHCC-LM3 HEK293T细胞系 BALB/c裸鼠皮下异种移植瘤模型 HCC临床组织样本
重点核对
ASPM与FOXM1的相互作用及LLPS形成 ASPM对FOXM1蛋白稳定性的影响及其依赖蛋白酶体的降解 ASPM敲低和过表达对HCC细胞增殖和体内肿瘤生长的影响 FOXM1对ASPM的转录调控及相关启动子结合位点 ASPM和FOXM1共表达与预后的相关性
摘要
背景
叉头框蛋白M1（FOXM1）在包括肝细胞癌（HCC）在内的多种癌症的发生和发展中发挥关键作用。然而，FOXM1的确切调控层级仍不清楚。在此，我们进行了全基因组筛选，以鉴定通过液-液相分离（LLPS）促进FOXM1转录活性的核内蛋白。
结果
我们鉴定出异常纺锤样小头畸形相关蛋白（ASPM）通过LLPS与FOXM1蛋白相互作用，并通过阻止蛋白酶体介导的降解来增强其稳定性。ChIP测序数据显示，ASPM和FOXM1共同占据多个基因的启动子以促进其转录，增强FOXM1驱动的致癌进展。在功能实验中，抑制ASPM可在体内和体外抑制HCC细胞的肿瘤生长，而过表达ASPM则产生相反的效果。重要的是，回补FOXM1可部分补偿由ASPM沉默引起的HCC细胞增殖能力减弱。有趣的是，FOXM1结合ASPM的启动子区域并转录激活ASPM在HCC细胞中的表达。此外，我们发现ASPM和FOXM1的更高共表达与HCC患者的较差预后显著相关。这表明ASPM和FOXM1之间存在一个双正反馈回路，协同促进HCC的侵袭性进展。
结论
总体而言，我们证明了LLPS和转录调控在ASPM和FOXM1之间形成了一个致癌的双正反馈回路。这为通过靶向该机制治疗HCC提供了合理的策略。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- ASPM是否通过液-液相分离介导FOXM1的核滞留并促进肝细胞癌进展？
- 核心机制
- ASPM与FOXM1通过液-液相分离形成动态凝聚体，增强FOXM1蛋白稳定性，抑制蛋白酶体介导的降解；同时FOXM1转录激活ASPM表达，形成双正反馈环路促进HCC进展。
- 主要证据
- 体外细胞实验、裸鼠移植瘤模型、临床样本分析、ChIP-seq和ChIP-qPCR等证据表明ASPM与FOXM1相互作用、共定位于核内，共同调控下游基因表达，且ASPM敲低抑制肿瘤生长，FOXM1回补逆转表型。
- 研究意义
- 该研究揭示ASPM-FOXM1双正反馈环路是HCC的潜在预后标志物和治疗靶点，为治疗HCC提供合理策略。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
验证ASPM与FOXM1的相互作用及相分离
验证ASPM与FOXM1的物理相互作用及其是否形成液-液相分离凝聚体。
通过Co-IP、免疫荧光、共聚焦显微镜、FRAP、超分辨显微镜和分子对接等技术验证ASPM与FOXM1的相互作用、共定位及动态凝聚体形成。
机制研究：ASPM对FOXM1蛋白稳定性的影响
阐明ASPM如何调控FOXM1的蛋白水平及降解途径。
通过siRNA敲低ASPM检测FOXM1蛋白和mRNA水平，使用CHX、MG132和BafA1处理评估FOXM1半衰期及降解途径，并检测FOXM1的泛素化水平。
功能验证：ASPM对HCC细胞增殖和体内肿瘤生长的影响
评估ASPM在HCC细胞增殖和体内肿瘤生长中的作用。
通过CCK-8、克隆形成、EdU掺入实验检测体外增殖，并通过裸鼠皮下移植瘤模型评估体内肿瘤生长和生存期。
转录调控：FOXM1对ASPM的转录激活
验证FOXM1是否直接结合ASPM启动子并转录激活ASPM表达。
通过siRNA敲低FOXM1检测ASPM表达，利用ChIP-qPCR和双荧光素酶报告基因实验验证FOXM1与ASPM启动子的结合及转录激活。
临床相关性分析
评估ASPM和FOXM1共表达与HCC患者预后的关系。
通过免疫组化检测临床样本中ASPM和FOXM1的表达，并利用TCGA、GEO等数据库分析其共表达及预后关联。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
验证细胞功能变化
评估体内效果
数据分析与统计
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 细胞培养 | RPMI 1640培养基 | GIBCO BRL | -- |
| DMEM培养基 | GIBCO BRL | -- | |
| 胎牛血清 | GIBCO BRL | -- | |
| 青霉素 | -- | -- | |
| 链霉素 | -- | -- | |
| 药物处理 | 巴佛洛霉素A1 | Selleck | S1413 |
| MG132 | GLPBIO | GC10383 | |
| Western blot | 抗FOXM1抗体 | Santa Cruz Biotechnology | sc-376471 |
| 抗ASPM抗体 | Proteintech | 26223-1-AP | |
| 抗GAPDH抗体 | Proteintech | 10494-1-AP | |
| 抗组蛋白H3抗体 | Cell Signaling Technology | 9715 | |
| 抗SOX2抗体 | EPITOMICS | 2683-1 | |
| 抗细胞周期蛋白E1抗体 | Abcam | ab3927 | |
| 抗XIAP抗体 | Abcam | ab21278 | |
| 抗整合素α5抗体 | Cell Signaling Technology | 98204 | |
| 抗LaminA/C抗体 | Proteintech | 10298-1-AP | |
| RT-qPCR | TRIzol试剂 | Invitrogen | -- |
| PrimeScript RT预混液 | TaKaRa | -- | |
| SYBR绿色PCR预混液 | TaKaRa | -- | |
| ChIP-seq | NEBNext® Ultra™ DNA文库制备试剂盒 | NEB | -- |
| Qubit® DNA检测试剂盒 | Life Technologies | -- | |
| Qubit® 2.0荧光计 | Life Technologies | -- | |
| NanoPhotometer®分光光度计 | IMPLEN | -- | |
| FRAP | 奥林巴斯FV3000倒置共聚焦显微镜 | Olympus | -- |
| 亚细胞分离 | Qproteome细胞组分分离试剂盒 | QIAGEN | 1073571 |
| 双荧光素酶报告基因 | 双荧光素酶报告基因检测系统 | Promega | -- |
| ChIP | SimpleChIP酶法染色质免疫沉淀试剂盒 | Cell Signaling Technology | 9003 |
| EdU增殖检测 | Meilun EdU细胞增殖检测试剂盒（Alexa Fluor 555） | Meilunbio | MA0425 |
| 细胞活力检测 | CCK-8细胞计数试剂盒 | -- | -- |
| 克隆形成实验 | 结晶紫 | Sigma Aldrich | -- |
| Odyssey扫描仪 | LI-COR | -- | |
| 免疫组织化学 | DAB显色剂 | Servicebio | G1211 |
| 质粒构建 | pLKO.1-TRC克隆载体 | Addgene | 10878 |
| pCDH载体 | -- | -- | |
| pcDNA3.1-mCherry载体 | -- | -- | |
| pcDNA3.1-GFP载体 | -- | -- | |
| pCMV-ASPM-3×Flag质粒 | Genechem | -- | |
| siRNA转染 | siASPM#1 | GenePharma | -- |
| siASPM#2 | GenePharma | -- | |
| siControl | GenePharma | -- | |
| 转染 | Lipofectamine 2000转染试剂 | Invitrogen | -- |
| 免疫共沉淀 | G蛋白磁珠 | Thermo Fisher | -- |
| 免疫染色 | Alexa Fluor 488荧光染料 | Life Technologies | -- |
| Alexa Fluor 555荧光染料 | Life Technologies | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 细胞培养 | 细胞系来源及培养条件：MHCC-LM3和SNU-739使用RPMI 1640培养基，HepG2和HEK293T使用DMEM培养基，均添加10% FBS、100 µg/ml青霉素和100 µg/ml链霉素。 阅读提示：参见 Methods 中 "Cell lines and cell culture conditions" |
| 药物处理 | 药物处理浓度和时间：BafA1 (250 nM, 12h), MG132 (20 μM, 12h), CHX (50 μg/ml)。 阅读提示：参见 Methods 中 "Cell line treatments" 和 "Protein stability assay" |
| 免疫组化 | 抗体使用及稀释度：抗FOXM1 (1:50, Santa Cruz), 抗ASPM (1:100, Proteintech)。 阅读提示：参见 Methods 中 "Immunohistochemistry (IHC) staining and analysis" |
| 体外增殖检测 | 细胞数量及检测时间：CCK-8实验每孔1×10^3细胞；克隆形成每孔1000细胞，培养2周；EdU实验细胞培养过夜后孵育10 μM EdU 2-3小时。 阅读提示：参见 Methods 中 "Cell viability assay", "Colony formation assay", "EdU cell proliferation" |
| 动物实验 | 动物模型：8周龄雄性BALB/c裸鼠，皮下接种1×10^7 HCC细胞，肿瘤体积公式0.5×L×W²。 阅读提示：参见 Methods 中 "Animal studies" |
| ChIP实验 | 细胞数量、交联条件及抗体：1.2×10^7细胞，1%甲醛交联15分钟，FOXM1抗体（Santa Cruz）或IgG。 阅读提示：参见 Methods 中 "Chromatin immunoprecipitation assay" |
| 双荧光素酶报告基因 | 转染质粒及检测方法：pGL3-ASPM-promoter, pRL-TK, pCMV-FOXM1/GFP，使用Lipofectamine 2000转染，双荧光素酶检测系统。 阅读提示：参见 Methods 中 "Dual luciferase reporter assay" |