患者样本circRNA微阵列分析
鉴定乳腺癌中差异表达的反义circRNA
从三对乳腺癌和癌旁组织中分离总RNA，RNase R处理去除线性RNA，扩增后与Arraystar Human circRNA Array v2杂交，筛选差异表达circRNA。
关于丁香通
公司信息
个人用户
企业机构
无忧采购 轻松科研
- 移动端
反义环状RNA circSCRIB通过抑制亲本基因剪接和翻译促进癌症进展
An antisense circular RNA circSCRIB enhances cancer progression by suppressing parental gene splicing and translation
实验完整度
高研究包含患者样本高通量筛选、细胞系功能实验（增殖/迁移/侵袭/存活）、RNA pull-down验证相互作用、RT-PCR检测剪接/翻译、体内异种移植瘤实验及免疫组化验证。
主要模型
人乳腺癌细胞系Skbr-3 人乳腺癌细胞系MDA-MB-231 人乳腺癌细胞系HTB-126 CD-1雌性裸鼠皮下移植瘤模型
重点核对
患者乳腺肿瘤及癌旁组织样本（三对）用于circRNA微阵列分析 Skbr-3细胞瞬时转染circScrib220、circScrib236、circScrib570及circScribEx构建体 RNA pull-down实验使用生物素标记的探针验证circRNA与pre-mRNA/mRNA相互作用 体内异种移植实验使用Skbr-3细胞（4×10^7细胞）皮下注射入裸鼠 通过siRNA敲低内源circScrib570验证其对细胞功能的影响
摘要
环状RNA（circRNA）代表一大组非编码RNA，广泛存在于哺乳动物细胞中。虽然大多数circRNA以正义方向生成，但有一组circRNA以反义方向合成。对乳腺癌标本的高通量分析揭示了209个反义circRNA的显著富集。肿瘤抑制因子SCRIB可能产生十三个circRNA，其中三个为反义方向。在这三个circRNA中，circSCRIB（hsa_circ_0001831）在乳腺癌面板中富集最多。该反义SCRIB circRNA跨越一个内含子和两个外显子。我们假设该circRNA可以减少前体mRNA剪接和mRNA翻译。为了验证这一点，我们生成了hsa_circ_0001831表达构建体。我们发现SCRIB mRNA产生减少，但癌细胞增殖、迁移和侵袭增加。相比之下，外显子序列构建体不影响mRNA剪接但减少蛋白质翻译，导致E-钙粘蛋白表达增加，N-钙粘蛋白和波形蛋白表达减少。因此，细胞迁移、侵袭、增殖、集落形成和肿瘤发生增加。我们的研究揭示了反义circRNA对其亲本转录本的新调节作用。这可能代表开发circRNA定向治疗的有前景的方法。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- 反义circRNA是否及如何调控其亲本基因表达，从而影响癌症进展？
- 核心机制
- 含内含子的反义circRNA（circScrib220/236/570）与SCRIB pre-mRNA结合，抑制剪接，减少SCRIB mRNA；而仅外显子序列的circScribEx与成熟SCRIB mRNA结合，抑制翻译，减少SCRIB蛋白。
- 主要证据
- 患者样本中circSCRIB高表达且与SCRIB mRNA负相关；细胞实验证实circScribEx降低SCRIB蛋白并促进增殖、迁移、侵袭和集落形成；体内实验显示circScribEx促进肿瘤生长且伴有E-cadherin升高和N-cadherin/vimentin降低。
- 研究意义
- 揭示了反义circRNA对亲本转录本的新型调控作用，并可能为circRNA定向癌症治疗提供潜在靶点。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
反义circRNA表达验证
验证circSCRIB在癌症样本和细胞系中的表达及与SCRIB mRNA的相关性
通过实时PCR检测患者组织和多种乳腺癌细胞系中circSCRIB水平，并分析其与SCRIB mRNA的相关性。
反义circRNA功能实验
评估反义circRNA对细胞增殖、迁移、侵袭和存活的影响
将circScrib220、circScrib236、circScrib570或circScribEx转染Skbr-3细胞，通过增殖、迁移、侵袭和存活试验检测细胞行为。
剪接和翻译机制验证
验证反义circRNA抑制pre-mRNA剪接和mRNA翻译的机制
通过RT-PCR检测pre-SCRIB和成熟SCRIB mRNA水平；RNA pull-down验证circRNA与pre-mRNA/mRNA结合；亚细胞分级检测circRNA定位；Western blot检测SCRIB蛋白水平。
体内肿瘤形成实验
验证circScribEx对肿瘤生长的促进作用
将稳定表达circScribEx的Skbr-3细胞皮下注射至裸鼠，20天后测量肿瘤大小及相关标志物表达。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
验证样本或模型特征
评估体内效果
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 免疫检测 | 兔多克隆抗SCRIB抗体 | GeneTex | GTX107692 |
| Western blot | 辣根过氧化物酶标记的山羊抗小鼠IgG | Bio-Rad | -- |
| 辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔IgG | Bio-Rad | -- | |
| RNA提取 | QIAGEN RNeasy小提试剂盒 | QIAGEN | -- |
| RT和PCR | QIAGEN RNA逆转录和PCR试剂盒 | QIAGEN | -- |
| 亚细胞分离 | 核质RNA纯化试剂盒 | Fisher Scientific | -- |
| Western blot | ECL Western blot检测试剂盒 | Amersham Biosciences | -- |
| 免疫组化 | 生物素显色检测试剂盒 | Thermo Scientific | -- |
| RNA pull-down | Dynabeads MyOne链霉亲和素C1磁珠 | Invitrogen | -- |
| Protein A-Sepharose 4B偶联物 | Invitrogen | -- | |
| RNA酶处理 | 核糖核酸酶R | Epicenter | -- |
| 实时PCR | miScript SYBR Green PCR试剂盒 | QIAGEN | -- |
| 免疫组化 | Vectastain Elite ABC试剂盒 | Vector Laboratories | -- |
| 过氧化物酶底物试剂盒 | Vector Laboratories | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| circRNA微阵列分析 | 患者样本来源、微阵列平台（Arraystar Human circRNA Array v2） 阅读提示：Materials and methods - Microarray of samples from breast cancer patients |
| 细胞培养和转染 | 所用细胞系（Skbr-3等）、转染试剂、转染量（如circScribEx用量） 阅读提示：Materials and methods - Constructs and primers; Figure legends 3 and 5 |
| RNA pull-down实验 | 探针序列、生物素标记、磁珠类型（Dynabeads MyOne Streptavidin C1） 阅读提示：Materials and methods - RNA pull-down assays |
| 体内肿瘤形成实验 | 动物品系（CD-1雌性裸鼠）、周龄（4周）、细胞注入量（4×10^7）、Matrigel浓度（10%）、观察时间（20天） 阅读提示：Materials and methods - Tumor growth assay |
| Western blot | 一抗（SCRIB抗体）来源和稀释度、二抗、膜封闭条件（5%脱脂牛奶）、ECL检测 阅读提示：Materials and methods - Western blot |