Nucleic acid aptamer controls mycoplasma infection for inhibiting the malignancy of esophageal squamous cell carcinoma
含临床样本检测、体外细胞模型、体内移植瘤转移模型及分子机制验证等多个独立证据层级
Eca-109细胞（人食管鳞癌细胞系） KYSE-150细胞（人食管鳞癌细胞系） BALB/c裸鼠（尾静脉注射肿瘤转移模型） M. hyorhinis感染细胞模型
M. hyorhinis感染Eca-109细胞（105 CCU/mL） ZY3A浓度（2 μM）及处理时间（48小时） 体内实验分组（DPBS、Lib-PEG、ZY3A-PEG、阿奇霉素）及剂量（20 mg/kg ZY3A-PEG，12 mg/kg阿奇霉素） 细胞密度（3×104细胞/孔用于Transwell） qPCR检测p37水平相对ACTB表达
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
明确猪鼻支原体感染对ESCC细胞增殖、迁移、侵袭及体内转移的影响。
通过qPCR检测临床组织样本中的M. hyorhinis DNA；使用105 CCU/mL M. hyorhinis感染Eca-109细胞，经Hoechst染色和PCR确认感染；CCK8、划痕愈合、Transwell实验评估增殖、迁移和侵袭能力；尾静脉注射感染或未感染的Eca-109/luc细胞至裸鼠，通过活体成像和H&E染色评估肺转移。
获得特异性结合M. hyorhinis感染的ESCC细胞的DNA适配体并优化其序列。
以M. hyorhinis感染的Eca-109细胞为正筛靶细胞，未感染细胞为反筛细胞进行cell-SELEX；流式监测富集，高通量测序后合成候选适配体，筛选出ZY3；对ZY3进行截短获得ZY3A并评估其结合亲和力；对ZY3A进行硫代磷酸酯修饰和3'端反向dT修饰以提高稳定性。
确定ZY3A在M. hyorhinis感染细胞表面的分子靶点。
用蛋白酶K或胰蛋白酶处理感染细胞以去除表面蛋白，流式检测ZY3A结合；提取膜蛋白进行pulldown，银染后LC-MS/MS鉴定靶蛋白；Western blot和ELONA验证ZY3A与p37的结合；分子对接和分子动力学模拟分析结合模式。
检测ZY3A能否预防和治疗M. hyorhinis对ESCC细胞的感染及机制。
在感染前或感染后加入不同浓度ZY3A，通过qPCR和免疫荧光检测感染率；计算IC50；GST pull-down和免疫共沉淀检测p37与TLR4相互作用及ZY3A的阻断效果。
评估ZY3A在体外对M. hyorhinis感染增强的ESCC细胞迁移和侵袭的影响及其分子机制。
对M. hyorhinis感染的Eca-109和KYSE-150细胞施加ZY3A、库序列或阿奇霉素处理，通过划痕和Transwell实验检测迁移和侵袭；Western blot检测p65、p-p65和MMP2水平。
验证ZY3A在动物模型中对M. hyorhinis感染的ESCC细胞肺转移的影响及安全性。
建立Eca-109/luc细胞尾静脉转移模型，分组给予PEG化的ZY3A、库序列、阿奇霉素或DPBS，定期活体成像，21天后处死，H&E染色计数肺转移结节，qPCR检测肺组织M. hyorhinis载量，监测体重变化。
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| DNA提取和PCR | QIAamp DNA FFPE组织试剂盒 | Qiagen | -- |
| DNA提取 | Dzup DNA分离试剂 | Sangon Biotechnology | -- |
| qPCR | SYBR Green实时PCR预混试剂盒 | Bimake | -- |
| 细胞培养 | DMEM培养基 | -- | -- |
| RPMI-1640培养基 | -- | -- | |
| 胎牛血清 | BI | -- | |
| 支原体培养 | 猪鼻支原体 | -- | -- |
| 免疫印迹 | 抗p37抗体 | Creative Biolabs | HPAB-0208-YJ |
| 抗GST抗体 | Cell Signaling Technology | 2625 | |
| 抗GAPDH抗体 | Cell Signaling Technology | 5174 | |
| 抗TLR4抗体 | Santa Cruz | sc-293072 | |
| 抗MMP2抗体 | Abcam | ab92536 | |
| 抗NF-κB p65抗体 | ThermoFisher | PA5-16545 | |
| 抗磷酸化NF-κB p65抗体 | ThermoFisher | MA5-15160 | |
| 核染色 | Hoechst 33258 | Beyotime Biotechnology | C1017 |
| 药物处理 | 阿奇霉素水合物 | MedChemExpress | HY-17506A |
| 支原体检测 | 支原体PCR检测试剂盒 | GeneCopoeia | MP004 |
| 重组蛋白表达 | pGEX-4T1载体 | -- | -- |
| 细胞-SELEX | 链霉亲和素包被的琼脂糖珠 | GE Healthcare | -- |
| 链霉亲和素包被的磁珠 | Spherotech | -- | |
| Transwell实验 | 8.0 μm孔径Transwell小室 | Corning | -- |
| Transwell侵袭实验 | 基质胶 | Corning | -- |
| 蛋白提取 | 膜蛋白提取试剂盒 | Beyotime Biotechnology | -- |
| 动物实验 | BALB/c裸鼠 | Hunan SJA Laboratory Animal Company | -- |
| 体内成像 | IVIS Lumina II成像系统 | Caliper LifeScience | -- |
| D-荧光素 | -- | -- | |
| 适配体PEG化 | 20 kDa PEG-马来酰亚胺 | Aladdin Biochemical Technology | -- |
| 适配体浓度测定 | Nanodrop分光光度计 | Thermo Scientific | -- |
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 细胞培养 | 细胞系来源、培养基种类及血清浓度 阅读提示：Materials and methods: Cell lines and cell culture |
| 支原体感染 | M. hyorhinis株（ATCC17981）、感染滴度（105 CCU/mL）及感染时间 阅读提示：Materials and methods: M. hyorhinis culture and infection |
| 适配体筛选 | 正筛细胞（感染Eca-109，1×107）、反筛细胞（未感染Eca-109，5×106）、文库浓度（初始10 nmol）、筛选轮数（21轮） 阅读提示：Materials and methods: Cell-SELEX procedures |
| 中和实验 | ZY3A浓度范围、预防模型（感染前预处理30分钟）和治疗模型（感染后处理48小时）、细胞密度（5×104） 阅读提示：Materials and methods: M. hyorhinis neutralization analysis |
| 体内实验 | 细胞数（2×106）、给药方案（每日一次至第3天，后隔日一次）、剂量（ZY3A-PEG 20 mg/kg静脉注射，阿奇霉素12 mg/kg腹腔注射）、处理周期（21天） 阅读提示：Materials and methods: Tumor metastasis assays in nude mice |
