srRNA载体筛选
鉴定最优的srRNA载体骨架和转基因配置
构建并筛选了多种甲病毒来源的srRNA载体，评估其蛋白表达和体内免疫原性，确定了EEEV骨架为最优候选。
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下一代EEEV自复制RNA平台增强用于联合癌症免疫治疗的效力
Enhanced efficacy of a next-generation EEEV self-replicating RNA platform for combination cancer immunotherapies
实验完整度
高研究包含体外蛋白表达筛选、体内免疫原性评估、多个小鼠肿瘤模型疗效验证及机制性T细胞分析。
主要模型
MM3MG-HER2Δ16小鼠乳腺癌模型 MC38小鼠结直肠癌模型 B16-F10小鼠黑色素瘤模型 BALB/c小鼠免疫模型
重点核对
RBI-1000在0.1 μg剂量下表现出显著肿瘤生长控制和生存改善 RBI-2000在1和10 μg剂量下显著抑制MC38肿瘤生长 RBI-2000与抗PD-1联合用药显著延长生存期并产生8/10完全应答 EEEV载体相比VEEV诱导更高的ESR1特异性T细胞反应
摘要
自复制RNA（srRNA）技术已获首个批准，包括Kostaive和GEMCOVAC COVID-19疫苗的紧急使用授权。srRNA疫苗的有效剂量远低于传统mRNA，因为srRNA驱动更高的蛋白表达，并具有病毒载体的特性，可增强免疫原性。重要的是，srRNA编码病毒复制酶，通常来源于委内瑞拉马脑炎病毒（VEEV）的非结构蛋白（nsP），有助于扩增所编码的转基因。nsP还影响关键细胞过程，包括蛋白质翻译和加工、炎症和自噬，这些可影响下游性能。在这里，我们展示了一种源自东部马脑炎病毒（EEEV）的下一代srRNA载体，该载体是从更广泛的甲病毒筛选中鉴定出来的，在两种免疫治疗应用RBI-1000和RBI-2000中具有高效力。RBI-1000是一种靶向乳腺癌获得性耐药突变的多基因疫苗，能够引发针对肿瘤相关抗原和新抗原的抗原特异性免疫反应。此外，RBI-2000是一种IL-12和IL-1RA联合生物治疗药物，其治疗水平的蛋白表达在体内增强了抗肿瘤免疫反应。RBI-1000和RBI-2000均在临床前肿瘤模型中成功证明了有效性。这些数据表明，经验性评估新的srRNA载体对于开发适合用途的疗法非常重要。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- 基于EEEV的srRNA平台是否能增强癌症免疫治疗的疗效？
- 核心机制
- EEEV srRNA载体通过驱动更高的转基因表达和增强抗原特异性T细胞免疫，从而提升抗肿瘤效果。
- 主要证据
- 在MM3MG-HER2Δ16、MC38和B16-F10模型中，RBI-1000和RBI-2000均表现出肿瘤生长抑制和生存改善。
- 研究意义
- 该平台展示了扩展现有srRNA技术至其他甲病毒的优势，可能用于更有效的免疫治疗。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
RBI-1000疫苗设计
确定多表位新抗原盒和四基因配置的最优组合
设计并比较不同ESR1新抗原盒和链接序列，筛选Tetragenic 1为铅候选，并验证其免疫原性。
RBI-1000体内抗肿瘤功效
评估RBI-1000在HER2阳性乳腺癌模型中的抗肿瘤效果
免疫MM3MG-HER2Δ16肿瘤小鼠，检测肿瘤生长、生存率和T细胞反应。
RBI-2000设计及表达评估
验证RBI-2000表达的IL-12和IL-1RA的生物活性
构建并比较不同配置的RBI-2000，在体内外检测IL-12p70和IL-1RA表达及IFNγ诱导。
RBI-2000在CPI敏感和难治模型中的功效
评估RBI-2000单独或联合抗PD-1在不同肿瘤模型中的抗肿瘤效果
在MC38和B16-F10模型中，瘤内注射RBI-2000，监测肿瘤生长和生存。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 载体构建 | Gibson组装 | -- | -- |
| RNA合成 | HiScribe T7高产RNA合成试剂盒 | NEB | -- |
| RNA加帽 | 痘苗病毒加帽系统 | NEB | -- |
| mRNA帽2'-O-甲基转移酶 | NEB | -- | |
| RNA纯化 | 氯化锂沉淀 | -- | -- |
| RNA浓度测定 | NanoDrop分光光度计 | Thermo Fisher Scientific | -- |
| LNP制备 | NanoAssemblr Ignite微流控仪 | Cytiva | -- |
| LNP表征 | 动态光散射 | -- | -- |
| RiboGreen检测 | -- | -- | |
| 细胞转染 | Lonza 4D核转染仪 | Lonza Group AG | -- |
| 流式分析 | PE偶联抗dsRNA单克隆抗体J2 | Novus Biologicals | 703-0010 |
| 抗dsRNA抗体J2 | Jena Biosciences | RNT-SCI-10010200 | |
| 蛋白表达 | 抗ERα兔抗体 | Bethyl | A300-497A |
| AF800偶联抗兔山羊抗体 | Thermo | A32735 | |
| 抗PI3KCA兔抗体 | Thermo | PA587398 | |
| eBioscience Foxp3 / 转录因子染色缓冲液套装 | Invitrogen | -- | |
| AF488偶联抗HER2小鼠单克隆抗体(24D2) | Biolegend | -- | |
| APC偶联抗HER3小鼠单克隆抗体(IB4C3) | Biolegend | -- | |
| 人IL-12p70 ELISA试剂盒 | R&D Systems | DY1270 | |
| 人IL-1RA/IL-1F3 DuoSet ELISA试剂盒 | R&D Systems | DY280 | |
| 生物活性测定 | IL-12 GloMax生物测定 | Promega | JA2601 |
| IL-1β报告基因HEK 293细胞 | Invivogen | hkb-il1bv2 | |
| 细胞刺激 | 布雷菲德菌素A | BioLegend | -- |
| 莫能菌素 | BioLegend | -- | |
| CD28 | BioLegend | -- | |
| PMA | -- | -- | |
| 离子霉素 | Sigma-Aldrich | -- | |
| 流式染色 | 可固定活性染料 | Invitrogen | -- |
| FoxP3固定/破膜试剂盒 | eBioscience | -- | |
| 抗体：CD45, IL-2, CD4, CD8b, IFNγ, CD44, TNFα, CD11b | BioLegend | -- | |
| 流式细胞仪 | LSR II流式细胞仪 | BD Bioscience | -- |
| 数据分析 | FlowJo软件 | TreeStar | -- |
| ELISpot | AIM V培养基 | Gibco | -- |
| 胎牛血清 | Invitrogen | -- | |
| ELISpot PLUS试剂盒 | Mabtech | -- | |
| ESR1肽段 | -- | -- | |
| HER2 PepMix库 | JPT | -- | |
| HER3重叠肽库 | Biosynth | -- | |
| 重组HER3 ECD | Sino Biological | -- | |
| ELISA | 重组HER2或HER3蛋白 | Sino Biologicals | -- |
| 抗小鼠IgG-辣根过氧化物酶 | -- | -- | |
| 1-Step TMB Ultra底物 | ThermoFisher | -- | |
| GlowMax Discover酶标仪 | Promega | -- | |
| 动物实验 | 抗PD-1抗体(克隆号RMP1-14) | -- | -- |
| 大鼠IgG2a同型对照 | BioXCell | -- | |
| 细胞培养 | RPMI培养基 | -- | -- |
| DMEM培养基 | -- | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| RBI-1000免疫效果评估 | 6-8周龄雌性BALB/c小鼠，肌注免疫，剂量0.1、1、10 μg，第0天和/或第21天，第14天取脾检测T细胞反应 阅读提示：Methods: In vivo mouse studies; Figure 1 legend |
| MM3MG-HER2Δ16肿瘤模型 | 6-8周龄雌性BALB/c小鼠，乳腺脂肪垫接种2×10^5细胞，第3天和第17天肌注免疫，监测肿瘤体积至2000mm3，第27天分析免疫反应 阅读提示：Methods: In vivo mouse studies; Figure 2 legend |
| MC38和B16-F10肿瘤模型 | 6-9周龄雌性C57BL/6小鼠，皮下接种MC38 (1×10^6)或B16-F10 (2×10^5)，肿瘤体积30-70mm3时随机分组，瘤内注射RBI-2000，抗PD-1 (10mg/kg i.p.) 阅读提示：Methods: In vivo mouse studies; Figure 4 and 5 legends |
| srRNA构建 | 通过Gibson Assembly组装多基因，使用体外转录合成RNA，加帽，LiCl纯化，LNP制剂 阅读提示：Methods: srRNA construct generation, RNA generation and formulation |
| 免疫检测 | ELISpot肽段和浓度，流式抗体克隆和浓度 阅读提示：Methods: ELISpot, Flow cytometry; Table 1 |