腺病毒载体在体内感染B淋巴细胞

Adenoviral vectors infect B lymphocytes in vivo

作者信息Paul J Rice-Boucher, Samir Andrade Mendonça, Aluet Borrego Alvarez, Alexandria J Sturtz, Reka Lorincz, Igor P Dmitriev, Elena A Kashentseva, Zhi Hong Lu, Rosa Romano, Mark Selby, Kunal Pingale, David T Curiel
PMID37452494
期刊Mol Ther
发布时间2023-09-06
DOI10.1016/j.ymthe.2023.07.004

实验完整度

研究包含体外(细胞系、原代B细胞)和体内(小鼠模型)实验,并进行了功能验证(eGFP表达)和机制验证(纤维蛋白、CAR、整合素等)。

主要模型

小鼠原代B细胞 人类原代B细胞 C57BL/6J小鼠模型

重点核对

病毒剂量:1 × 10^11 vp/只(高剂量)和5 × 10^10 vp/只(低剂量) 感染方式:尾静脉注射(retro-orbitally) B细胞亚群:边缘区B细胞、生发中心B细胞、浆母细胞等 流式细胞术检测eGFP表达和细胞表面标志物 组织eGFP定量使用商业试剂盒(Cell BioLabs, AKR-120)

摘要

B细胞是适应性免疫系统中产生抗体的部分,在控制病原体方面发挥着关键作用。多个研究组现已证明使用工程化B细胞作为疗法的可行性,包括传染病控制和血清缺乏症的基因治疗。这些研究主要利用了离体细胞修饰。直接的体内工程化将对领域有用,特别是在传染病控制中,离体细胞修饰的基础设施需求将使广泛的疫苗接种活动极具挑战性。在本研究中,我们证明了工程化腺病毒载体能够在离体和体内高效转导小鼠和人类原代B细胞。我们发现未修饰的人腺病毒C5能够在体内感染B细胞,这可能是由于病毒五邻体基蛋白与整合素之间的相互作用。我们进一步描述了使用B细胞特异性基因启动子的载体修饰,并成功将转基因表达限制在B细胞中,导致肝脏(人腺病毒C5在体内感染的主要部位)中的基因表达显著降低。

实验结论

提炼研究问题、关键发现与证据,快速把握文章的核心贡献。

研究问题
能否利用工程化腺病毒载体在体内实现B细胞特异性的基因转移?
核心机制
腺病毒主要通过五邻体基蛋白与整合素(特别是αv和β3)相互作用感染B细胞,而非经典纤维蛋白-CAR通路。
主要证据
体外实验显示可溶性纤维蛋白预处理仅轻微降低转导,CAR结合缺陷病毒在B细胞中仍有感染性;整合素阻断肽GRGDSP显著抑制感染。体内eGFP+ B细胞富集整合素表达。
研究意义
本研究是首个报道腺病毒载体系统递送后可感染特定淋巴细胞群体的研究,为B细胞体内基因工程和传染病控制等应用奠定了基础。

研究路径

按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。

1

体外筛选病毒载体和启动子

评估不同纤维蛋白修饰的腺病毒载体和人B细胞特异性启动子在原代B细胞中的转导效率。

使用Ad5、AdRGD、AdPK4和SAd36感染小鼠和人类B细胞,并评估SFFV、EEK、MH和Wp1168等启动子。

2

体内评估载体转导和靶向性

评估候选载体(AdRGD.EEK)在小鼠体内的B细胞转导效率和靶向特异性。

C57BL/6J小鼠经尾静脉注射病毒,72小时后取脾脏、肝脏等器官,用流式细胞术和荧光定量检测eGFP表达。

3

机制研究:腺病毒感染B细胞的途径

明确腺病毒载体感染B细胞的分子机制。

采用可溶性纤维蛋白预处理、CAR结合缺陷病毒(Ad5E3gfpFFc3.luc)和整合素阻断肽孵育等方法,评估对转导效率的影响。

4

免疫表型分析

鉴定对腺病毒载体更易感的B细胞亚群。

通过流式细胞术分析不同B细胞亚群(脾脏)中eGFP+细胞的比例,以及相关表面标志物(GL7, CD95, CD38, IgD等)的表达。

研究方法

按研究目的归类文中使用的方法,便于定位所需技术。

产品清单

实验环节名称品牌货号
DMEM/F12 1:1培养基----
L-谷氨酰胺,15 mM HEPES,10%胎牛血清,100 U/mL青霉素-链霉素,Gibco,沃尔瑟姆,马萨诸塞州,11330-032Gibco11330-032
PacI限制性内切酶,新英格兰生物实验室,伊普斯威奇,马萨诸塞州New England Biolabs--
AbsI限制性内切酶,SibEnzyme,俄罗斯SibEnzyme--
pMVP/Ad/5-35-DEST,Addgene质粒编号121847,沃特敦,马萨诸塞州Addgene121847
pAdEasy1质粒----
NEB HiFi DNA组装试剂盒,新英格兰生物实验室New England Biolabs--
限制性内切酶 SrfI, SgrDI, PmeI, BarI, BstBI, SfiI, SwaINew England Biolabs--
BJ5183感受态细菌,安捷伦,圣克拉拉,加利福尼亚州Agilent--
合成间隔区Integrated DNA Technologies--
pHIV-SFFV-dCas9-BFP,Addgene质粒编号46910Addgene46910
pUC57m载体质粒GenScript--
磁珠分选试剂盒,美天旎,盖瑟斯堡,马里兰州,130-090-862Miltenyi130-090-862
B细胞分选试剂盒,干细胞技术公司,加拿大,17954Stem Cell Technologies17954
ACK裂解缓冲液,Gibco,A10492-01GibcoA10492-01
StemMACS HSC扩增培养基Miltenyi--
CD19抗体,Invitrogen,RM7717InvitrogenRM7717
Sytox Red染料,Invitrogen,S34859InvitrogenS34859
可固定远红染料,Invitrogen,L10120InvitrogenL10120
CD19抗体,BioLegend,302251BioLegend302251
Fc受体阻断剂,美天旎,130-092-575Miltenyi130-092-575
CD3抗体,Invitrogen,46-0032-82Invitrogen46-0032-82
CD45抗体,Invitrogen,47-0451-82Invitrogen47-0451-82
CD71抗体,BioLegend,113813BioLegend113813
CD95抗体,BD生物科学,563646BD Biosciences563646
CD138抗体,BioLegend,142515BioLegend142515
GL7抗体,BioLegend,144607BioLegend144607
CD38抗体,美天旎,130-125-522Miltenyi130-125-522
IgD抗体,Invitrogen,56-5993-80Invitrogen56-5993-80
IgM抗体,Invitrogen,47-5790-82Invitrogen47-5790-82
CD51抗体,BioLegend,104105BioLegend104105
CD61抗体,BioLegend,104313BioLegend104313
Zombie UV可固定活性染料,BioLegend,423107BioLegend423107
C57Bl/6J小鼠,杰克逊实验室The Jackson Laboratory--
eGFP定量试剂盒,Cell BioLabs,AKR-120Cell BioLabsAKR-120
Omni Prep 96匀浆机Omni--
蛋白酶抑制剂混合物,西格玛,P8340SigmaP8340

关键环节

汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。

环节核对要点
体外B细胞感染
小鼠B细胞激活条件、感染复数(MOI)和时间,人类B细胞激活条件,细胞密度
阅读提示:Methods: Primary B cell culture
体内载体剂量
每只小鼠注射的病毒颗粒数(1×10^11或5×10^10)
阅读提示:Methods: Animal studies
组织处理
组织保存方法(液氮)、eGFP定量试剂盒、匀浆条件
阅读提示:Methods: Animal studies
流式细胞术
抗体组合、荧光染料、活/死细胞鉴别、亚群定义
阅读提示:Methods: Flow cytometry