通过工程化Un1Cas12f1和连接Sso7d开发稳健的微型Cas转录调控系统

微型V-F CRISPR-Cas12f系统已被重新用于基因编辑和转录调控。Cas12f的小尺寸满足了腺相关病毒（AAV）用于基因治疗的包装容量。然而，Cas12f介导的转录激活效率在不同靶位点间存在差异。在此，我们利用Un1Cas12f1开发了一种稳健的微型Cas转录激活或沉默系统。我们对Un1Cas12f1及其同源向导RNA进行了工程化改造，生成了miniCRa，使ASCL1基因的激活水平提高了1319倍。通过将DNA结合蛋白Sso7d连接到miniCRa上生成SminiCRa，可进一步提高活性，使ASCL1基因激活达到5628倍，并对其他检测基因也实现了至少数百倍的激活。我们将Un1Cas12f1的这些突变应用于转录抑制，生成了miniCRi或SminiCRi，平均对八个基因实现了约80%的抑制。我们构建了一个一体化的AAV载体AIOminiCRi，用于沉默疾病相关基因SERPINA1。在Huh-7细胞中，AIOminiCRi AAV导致SERPINA1基因表达抑制了70%。总之，miniCRa、SminiCRa、miniCRi和SminiCRi是具有高特异性的稳健微型转录调控工具，扩展了生物医学研究和治疗应用的工具箱。