脂质纳米颗粒中mRNA和向导RNA的分布影响体内基因编辑效率

脂质纳米颗粒（LNPs）是CRISPR基因编辑疗法中最先进的非病毒载体之一。信使RNA（mRNA）和向导RNA（gRNA）的共包封本质上会产生异质的有效负载分布。这种异质性对编辑性能的影响尚不清楚。本研究利用柱面照明共聚焦光谱法（CICS）对通过三种不同混合方法制备的ALC-0315和DLin-MC3-DMA LNPs进行单颗粒检测。CICS解析出四个不同的亚群：共包封（50.7%-60.4%）、仅gRNA（30.0%-36.5%）、仅mRNA（2.0%-3.4%）和空颗粒（4.2%-13.8%），并揭示了每个类别中RNA拷贝数在颗粒间存在广泛的变异性。结构-功能分析表明，LNP配方和混合过程影响有效负载分布，导致空LNP比例与每个颗粒的RNA负载量呈负相关。我们进一步研究了这些质量属性与治疗性能之间的相关性。在小鼠中，尽管生物物理特性（包括LNP大小和RNA包封率）几乎相同，但携带更高货物负载的ALC-0315 LNPs（每个共包封颗粒含9.8对8.0个mRNA拷贝和25.4对20.3个gRNA拷贝）在体内产生了1.5倍更高的编辑活性（55.4%对36.3%的插入和缺失[indels]）。这些结果确立了有效负载分布是基因编辑效力的潜在决定因素，并证明了单颗粒CICS是合理设计多组分核酸递送系统的强大工具。