circRNA组学分析
鉴定AD模型与野生型小鼠脑中差异表达的circRNAs
对6和9月龄WT和APP/PS1小鼠脑组织进行RNA-seq，鉴定circRNAs，并用RT-qPCR验证部分circRNAs。
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已撤稿：circTulp4通过调控其亲本基因Tulp4参与阿尔茨海默病发病机制
RETRACTED: circTulp4 functions in Alzheimer’s disease pathogenesis by regulating its parental gene, Tulp4
实验完整度
高包含circRNA组学筛选、细胞实验（敲低/过表达、功能检测）、分子机制验证（RAP/RIP/ChIRP/ChIP）及ATAC-seq等表观遗传分析，多层级验证。
主要模型
APP/PS1转基因小鼠模型 野生型（WT）小鼠 原代海马神经元 Neuro-2a（N2a）细胞系
重点核对
circTulp4在不同年龄（2、6、9、12个月）WT和APP/PS1小鼠脑组织中的表达差异（rt-qPCR） circTulp4在细胞核/细胞质中的分布（FISH和核质分离） circTulp4与U1 snRNA及RNA聚合酶II的相互作用（RAP、RIP、ChIRP） circTulp4对染色质可及性的影响（ATAC-seq） 敲低circTulp4或Tulp4后神经元活力、神经突生长和分支的变化（CCK-8、免疫荧光）
摘要
阿尔茨海默病（AD）是全球最常见的神经退行性疾病之一，损害认知、记忆和语言能力并导致痴呆。然而，AD的发病机制仍知之甚少。最近，circRNAs与AD之间的潜在联系已被揭示，但只有少数可能参与AD的circRNAs被鉴定出来。在这里，我们通过深度RNA测序系统地研究了APP/PS1模型小鼠大脑中的circRNAs。我们报告circRNAs在大脑中显著富集，且多个circRNAs在野生型和APP/PS1小鼠之间表现出差异表达。我们表征了一个丰富的circRNA，circTulp4，它源自Tulp4基因的内含子1。我们的结果表明，circTulp4主要定位于细胞核，并与U1小核核糖核蛋白颗粒（snRNP）和RNA聚合酶II相互作用，以调节其亲本基因Tulp4的转录，从而调节神经系统的功能，并可能参与AD的发生发展。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- circTulp4是否通过调控其亲本基因Tulp4参与阿尔茨海默病的发病机制？
- 核心机制
- circTulp4主要定位于细胞核，通过与U1 snRNP和RNA聚合酶II相互作用，结合到Tulp4启动子区域，促进Tulp4的转录，从而调节神经元分化、存活和神经突生长，可能参与AD的发病。
- 主要证据
- RNA-seq鉴定circTulp4在APP/PS1小鼠中下调；FISH和核质分离显示其核定位；RAP/RIP/ChIRP验证其与U1 snRNP和Pol II相互作用；ATAC-seq显示circTulp4敲低影响多个远端染色质区域的可及性；功能实验显示敲低circTulp4或Tulp4抑制神经元活力和神经突生长，过表达Tulp4可拯救circTulp4敲低引起的效应。
- 研究意义
- 本研究首次在APP/PS1小鼠模型中全面分析circRNA表达谱，为AD的circRNA研究提供资源；circTulp4可能作为AD的生物标志物或治疗靶点。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
circTulp4特征验证
验证circTulp4的环状结构、表达水平和亚细胞定位
通过RNase R处理、Sanger测序验证circTulp4的环状结构；通过RT-qPCR、BaseScope、FISH和核质分离分析其表达和定位。
circTulp4对亲本基因Tulp4表达的调控
确定circTulp4是否调控Tulp4的表达
在原代海马神经元中用siRNA敲低circTulp4或过表达circTulp4，检测Tulp4 mRNA和蛋白水平。
circTulp4与U1 snRNP及RNA聚合酶II的相互作用
探究circTulp4调控Tulp4转录的分子机制
使用CatRAPID预测、RAP、RIP和ChIRP实验验证circTulp4与U1 snRNA、U1蛋白（U1A、SNRNP70）和RNA聚合酶II的相互作用，并通过ChIP分析U1A在Tulp4启动子区域的结合。
circTulp4对染色质可及性的影响
探讨circTulp4是否影响神经元基因的染色质可及性
在circTulp4 siRNA或对照siRNA处理的N2A细胞中进行ATAC-seq，分析差异可及性区域及其相关基因。
circTulp4和Tulp4对神经元功能的影响
验证circTulp4通过Tulp4调控神经元分化、活力和神经突生长
在原代海马神经元和细胞系中敲低circTulp4或Tulp4，检测细胞活力（CCK-8）、神经突长度和分支（免疫荧光）；并做拯救实验（共转染circTulp4 siRNA和pEGFP-Tulp4）。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
circRNA表达谱分析
验证circRNA特征
验证基因表达调控
验证RNA-蛋白相互作用
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| RNA提取 | TRIzol试剂 | Invitrogen | -- |
| RNA质量检测 | NanoPhotometer分光光度计 | Implen | -- |
| RNA定量 | Qubit RNA检测试剂盒 | Life Technologies | -- |
| Qubit 2.0荧光计 | Life Technologies | -- | |
| RNA完整性评估 | RNA Nano 6000检测试剂盒 | Agilent Technologies | -- |
| Bioanalyzer 2100系统 | Agilent Technologies | -- | |
| 细胞培养 | 多聚-D-赖氨酸 | Sigma | -- |
| Neurobasal培养基 | Life Technologies | -- | |
| B27添加剂 | Life Technologies | -- | |
| DMEM培养基 | Gibco | -- | |
| 胎牛血清 | HyClone | -- | |
| 马血清 | HyClone | -- | |
| 细胞分化诱导 | 视黄酸 | Sigma | -- |
| 神经生长因子 | Sigma | -- | |
| 转染 | Lipofectamine RNAiMAX转染试剂 | Invitrogen | -- |
| RT-qPCR | GoScript反转录系统 | Promega | -- |
| C1000热循环仪 | Bio-Rad | -- | |
| NanoDrop 2000分光光度计 | Thermo Fisher Scientific | -- | |
| 细胞活力检测 | CCK-8溶液 | MedChem Express | HY-K0301-100T |
| 酶标仪 | Bio-Rad | -- | |
| FISH | Cy3标记的circTulp4探针 | RiboBio | -- |
| FISH试剂盒 | RiboBio | -- | |
| DAPI | Life Technologies | -- | |
| 荧光显微镜 | Zeiss LSM 710共聚焦显微镜 | Zeiss | -- |
| 免疫荧光 | 抗β-微管蛋白III抗体 | Sigma | -- |
| CY3偶联的抗小鼠二抗 | Jackson ImmunoResearch | -- | |
| 抗荧光淬灭封片剂 | Beyotime | -- | |
| Western blot | RIPA裂解液 | -- | -- |
| 蛋白酶抑制剂混合物 | Sangon | -- | |
| Bradford蛋白定量 | -- | -- | |
| Western Lightning PLUS试剂盒 | PerkinElmer | NEL105001EA | |
| Quantity One软件 | Bio-Rad | -- | |
| ISH | BaseScope试剂盒 | Advanced Cell Diagnostics | -- |
| RAP | RAP试剂盒 | Bersin Bio | -- |
| RIP | RIP试剂盒 | Millipore | 17-701 |
| 抗RNA聚合酶II抗体 | Cell Signaling Technology | 2629 | |
| 抗U1A抗体 | Abcam | ab166890 | |
| 抗U2AF65抗体 | Abcam | ab37530 | |
| 抗SNRNP70抗体 | Millipore | CS203216 | |
| 蛋白酶K | -- | -- | |
| RNA提取试剂 | Solar Bio | -- | |
| ChIRP | ChIRP试剂盒 | Millipore | 17-10495 |
| 胰蛋白酶 | -- | -- | |
| 甘氨酸 | -- | -- | |
| Bioruptor超声破碎仪 | Diagenode | -- | |
| Pure Proteome链霉亲和素磁珠 | Millipore | CS219080 | |
| ATAC-seq | TruePrep DNA文库制备试剂盒V2（Illumina） | -- | -- |
| Illumina HiseqXten-PE150测序仪 | Illumina | -- | |
| ChIP | ChIP试剂盒 | Cell Signaling Technology | 56383 |
| 抗LSM10抗体 | Abcam | ab180128 | |
| 抗H3抗体 | Cell Signaling Technology | 4620 | |
| 统计分析 | PRISM软件 | GraphPad | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| circRNA表达谱分析 | 小鼠品系、年龄（6和9月龄）、性别（雄性）、每组样本数（3只）、RNA-seq建库方法和circRNA鉴定流程 阅读提示：Materials and methods 中 Animals、RNA-seq 部分 |
| circTulp4敲低实验 | siRNA序列及浓度（100 nM）、转染试剂（Lipofectamine RNAiMAX）、细胞类型（原代海马神经元、Neuro-2a）、处理时间（72小时） 阅读提示：Materials and methods 中 Transfection and RNA interference 部分；Figure legends 2G、6C-E |
| circTulp4过表达实验 | 腺病毒载体构建、感染复数（MOI）、处理时间、检测Tulp4表达的时间点 阅读提示：Materials and methods 中 Transfection and RNA interference 部分；Figure legend 2G |
| RNA-蛋白相互作用检测 | RAP/RIP/ChIRP实验的细胞数量（10^7或2×10^7）、探针序列、抗体货号、交联条件（甲醛或戊二醛浓度和时间） 阅读提示：Materials and methods 中 RAP、RIP、ChIRP 部分；Figure legends 3B-D |
| ATAC-seq | N2A细胞数量（50000/孔）、转染siRNA浓度、Tn5转座酶用量、PCR循环数（10-12）、测序平台（Illumina HiseqXten-PE150）、比对和peak calling参数 阅读提示：Materials and methods 中 ATAC seq 部分；Figure legend 5 |