验证BPTF调控HPSE表达及机制
探究BPTF是否通过识别H3K4me3调控HPSE表达
利用RNA-seq和RT-qPCR检测BPTF敲低后HPSE mRNA水平；CUT&Tag测序和qPCR检测BPTF和H3K4me3在HPSE启动子的结合；免疫共沉淀（IP）验证BPTF与H3K4me3相互作用。
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一种靶向BPTF的PROTAC降解剂增强基于NK细胞的癌症免疫治疗
A BPTF-specific PROTAC degrader enhances NK cell-based cancer immunotherapy
实验完整度
高包含体外细胞实验、蛋白质组学、CUT&Tag、动物模型（原位肝癌模型和人肝癌模型）等多层级验证，并有功能验证和机制验证。
主要模型
Huh7细胞系 人原代HCC细胞 小鼠原位肝癌模型 NCG小鼠人肝癌模型
重点核对
BPTF作为H3K4me3阅读器调控HPSE表达的机制验证 PROTAC 8d对BPTF的选择性降解及CRBN依赖性 8d处理增强NK细胞对HCC细胞的体外细胞毒性 8d处理抑制体内HCC生长且依赖NK细胞 8d对原发性HCC细胞中BPTF/HPSE/HSPG表达的影响
摘要
基于自然杀伤（NK）细胞的免疫治疗在癌症治疗中显示出前景，但其疗效仍然有限，因此需要开发新的策略。在本研究中，我们证明了表观遗传因子溴结构域PHD指状转录因子（BPTF）通过其PHD指对H3K4me3的识别来阻碍肝细胞癌（HCC）被NK细胞识别。我们生成了一种小分子蛋白降解靶向嵌合体（PROTAC），它能选择性降解人和鼠的BPTF。使用PROTAC降解BPTF直接增加HCC细胞上自然细胞毒性受体配体的丰度，促进其被NK细胞识别，从而在体外和体内增强NK细胞对HCC的细胞毒性。通过多学科技术，我们的研究结果表明，以PROTAC靶向BPTF是克服HCC逃避NK细胞免疫的一种有前景的方法，并为增强基于NK细胞的癌症免疫治疗提供了新策略。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- BPTF是否通过识别H3K4me3促进HPSE表达，从而帮助HCC逃避NK细胞识别？靶向BPTF的PROTAC能否增强NK细胞抗肿瘤免疫？
- 核心机制
- BPTF通过其PHD指识别H3K4me3，启动HPSE表达，HPSE切割HSPGs（NCR配体），降低HCC细胞表面NCR配体丰度，从而抑制NK细胞识别；PROTAC 8d通过泛素-蛋白酶体途径降解BPTF，恢复HSPG水平，增强NK细胞介导的细胞毒性。
- 主要证据
- 在Huh7细胞中，BPTF敲低或8d处理降低HPSE表达并增加HSPG水平；CUT&Tag和IP实验显示BPTF结合H3K4me3并富集于HPSE启动子；8d处理增强NK细胞对Huh7和原代HCC细胞的杀伤；体内实验中，8d抑制HCC生长，且NK细胞耗竭消除其作用。
- 研究意义
- 本研究首次将PROTAC技术应用于癌症免疫治疗，通过降解BPTF增强NK细胞抗肿瘤活性，为HCC治疗提供新靶点和新策略，并可能扩展到其他BPTF过表达的恶性肿瘤。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
设计合成靶向BPTF的PROTAC降解剂
开发特异性降解BPTF的PROTAC化合物
通过点击化学将BPTF抑制剂TP238与Pomalidomide连接，合成不同linker长度的PROTAC 8a-d及失活对照16/17；通过分子动力学模拟预测降解效率。
验证PROTAC 8d选择性降解BPTF
评估PROTAC对BPTF的降解效率及选择性
用不同浓度8d处理Huh7细胞，Western blot检测BPTF和HPSE；SPR测定8d与BPTF/BRD9/CECR2结合亲和力；蛋白质组学分析比较8d处理与BPTF KD的蛋白变化。
体外验证8d增强NK细胞对HCC细胞的杀伤
检测8d预处理HCC细胞是否增强NK细胞细胞毒性
将人原代NK细胞与8d预处理的Huh7或原代HCC细胞共培养，通过流式检测靶细胞凋亡及NK细胞活化标志物。
体内验证8d抑制HCC生长并依赖NK细胞
评估8d在体内的抗肿瘤效果及NK细胞依赖性
建立小鼠原位肝癌模型，给予8d处理，并设置NK细胞耗竭组；检测肿瘤大小、生存率、BPTF/HPSE/HSPG表达及肿瘤浸润NK细胞功能。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| PROTAC合成 | 泊马度胺 | -- | 19171-19-8 |
| 细胞培养 | DMEM培养基 | HyClone | -- |
| 胎牛血清 | Gibco | -- | |
| 青霉素/链霉素 | Gibco | -- | |
| RPMI 1640培养基 | -- | -- | |
| 细胞因子补充 | 白细胞介素-2 | -- | -- |
| 白细胞介素-15 | -- | -- | |
| 原代细胞分离 | 肿瘤解离试剂盒 | Miltenyi Biotec | 130-095-929 |
| 细胞培养 | ITS-G添加剂 | Pricella | PB180429 |
| Western blot | 蛋白酶抑制剂混合物 | Roche | -- |
| PVDF膜 | -- | -- | |
| ECL检测试剂 | Bio-Rad | #1705061 | |
| Azure 300成像仪 | Azure Biosystems | -- | |
| BRD9兔单克隆抗体 | CST | #58906 | |
| CECR2小鼠单克隆抗体 | Santa Cruz Biotechnology | sc-514878 | |
| BPTF兔单克隆抗体 | Abcam | ab72036 | |
| HPSE小鼠单克隆抗体 | Santa Cruz Biotechnology | sc-515935 | |
| HS小鼠单克隆抗体 | Millipore | #MAB2040 | |
| CRBN多克隆抗体 | Proteintech | 28494-1-AP | |
| 抗泛素小鼠单克隆抗体(NT) | PTM BIO | #PTM-5798 | |
| β-肌动蛋白(8H10D10)小鼠单克隆抗体 | Cell Signaling Technology | #3700 | |
| 抗兔IgG HRP偶联抗体 | Cell Signaling Technology | #7074 | |
| 抗小鼠IgG HRP偶联抗体 | Cell Signaling Technology | #7076 | |
| NK细胞分离 | Ficoll分离液 | -- | -- |
| NK细胞分离试剂盒 | Miltenyi Biotec | 130-092-657 | |
| NK细胞毒性实验 | 膜联蛋白V | BD Biosciences | 556419 |
| 7-AAD染料 | BD Biosciences | 559925 | |
| 流式细胞术 | CD56-FITC抗体 | BD Biosciences | 557699 |
| CD56-PE-Cy7抗体 | BD Biosciences | 557747 | |
| CD56-BV421抗体 | Biolegend | 362551 | |
| CD69-APC抗体 | BD Biosciences | 560711 | |
| CD69-FITC抗体 | BD Biosciences | 555530 | |
| NKG2D-PE-Cy7抗体 | BD Biosciences | 562365 | |
| NKp30-APC抗体 | BD Biosciences | 558408 | |
| NKp44-PE-Cy7抗体 | Biolegend | 325116 | |
| NKp46-PE抗体 | BD Biosciences | 557991 | |
| IFN-γ-FITC抗体 | Biolegend | 506504 | |
| TNF-α-PE抗体 | BD Biosciences | 559321 | |
| GZMB-FITC抗体 | BD Biosciences | 560211 | |
| 穿孔素-PE抗体 | BD Biosciences | 556437 | |
| 穿孔素-BV510抗体 | Biolegend | 308120 | |
| CD107a-APC抗体 | BD Biosciences | 560664 | |
| 颗粒酶B-BV421抗体 | BD Biosciences | 563389 | |
| CD45-APC-Cy7抗体 | Biolegend | 103116 | |
| CD3-PE-Cy7抗体 | Biolegend | 100320 | |
| NKP46-PE-Cy7抗体 | Biolegend | 137618 | |
| IFN-PerCP-Cy5.5抗体 | Biolegend | 505822 | |
| TNF-α-BV421抗体 | Biolegend | 506328 | |
| GZMB-PE抗体 | Biolegend | 372208 | |
| 穿孔素-APC抗体 | eBioscience | 17-9392-80 | |
| NKG2D-APC抗体 | eBioscience | 17-5882 | |
| CD107a-FITC抗体 | BD Biosciences | 553793 | |
| CD3-PE抗体 | BD Biosciences | 553064 | |
| NK1.1-BV510抗体 | BD Biosciences | 563096 | |
| 固定/通透缓冲液 | Thermo Fisher Scientific | 00-5523-00 | |
| BD Fortessa流式细胞仪 | BD Biosciences | -- | |
| BPTF敲低 | BPTF siRNA | Horizon Discovery | -- |
| Lipofectamine RNAiMAX转染试剂 | Thermo Fisher Scientific | 13778075 | |
| 蛋白质组学 | Easy-nLC 1200液相色谱系统 | Thermo Fisher Scientific | -- |
| Orbitrap Exploris 480质谱仪 | Thermo Fisher Scientific | -- | |
| 蛋白质组学分析 | MaxQuant软件 | -- | -- |
| SPR结合实验 | Biacore T200系统 | GE Healthcare | -- |
| NiHC1500M芯片 | XanTec bioanalytics | SCBS NiHC 1500M | |
| RNA-seq | FastPure细胞/组织总RNA提取试剂盒V2 | Nanjing Vazyme Biotech Co., Ltd | RC112-01 |
| RT-qPCR | HisScript III第一链合成试剂盒 | Nanjing Vazyme Biotech Co., Ltd | R312-01 |
| Taq Pro通用SYBR qPCR预混液 | Nanjing Vazyme Biotech Co., Ltd | R712-02 | |
| StepOnePlus实时荧光定量PCR仪 | Thermo Fisher Scientific | -- | |
| CUT&Tag-qPCR | Hyperactive通用CUT&Tag检测试剂盒（qPCR） | Nanjing Vazyme Biotech Co., Ltd | TD904-01 |
| CUT&Tag测序 | Hyperactive通用CUT&Tag检测试剂盒（Illumina Pro） | Nanjing Vazyme Biotech Co., Ltd | TD904-01 |
| 免疫沉淀 | 蛋白A/G琼脂糖珠 | Santa Cruz Biotechnology | sc-2003 |
| 流式细胞术 | FlowJo软件 | -- | -- |
| 图像分析 | ImageJ软件 | -- | -- |
| 统计 | GraphPad Prism 7.0软件 | -- | -- |
| 小鼠模型 | 玉米油 | -- | 8001-30-7 |
| NK细胞耗竭 | InVivoMAb抗小鼠NK1.1抗体 | Bioxcell | BE0036 |
| 小鼠IgG2a同型对照 | Bioxcell | BE0085 | |
| 体内成像 | D-荧光素 | -- | 2591-17-5 |
| IVIS Spectrum成像系统 | PerkinElmer | -- | |
| 超声成像 | Vinno 6超声扫描仪 | Vinno Corporation | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 细胞培养 | Huh7细胞系来源（中国科学院细胞库），培养基（DMEM+10% FBS+1% P/S），原代NK细胞培养基（RPMI 1640+IL-2 100 U/mL+IL-15 10 ng/mL） 阅读提示：Methods - Cell lines and cell culture |
| BPTF敲低实验 | siRNA序列（未明确说明），转染试剂（Lipofectamine RNAiMAX），转染时间（48 h） 阅读提示：Methods - Generation of BPTF KD Huh7 cells |
| PROTAC处理 | 8d浓度（10 μM），处理时间（24 h），对照（DMSO、TP238、16、17） 阅读提示：Results - PROTACs exhibits selective degradation of BPTF in HCC cells; Figure 3 |
| NK细胞毒性实验 | 效应/靶细胞比例（1:20），共培养时间（4 h），靶细胞预处理（8d 10 μM 24 h） 阅读提示：Methods - NK cell-mediated cytotoxicity assays; Figure 4A |
| 体内实验 | 小鼠品系（C57BL/6和NCG），肿瘤细胞系（鼠源HCC细胞和人Huh7-luc），注射细胞数（5×10^5和5×10^6），8d剂量（10 mg/kg）和给药途径（腹腔注射），给药时间（20天），NK细胞耗竭抗体剂量（300 μg）和频率（每3天） 阅读提示：Methods - Establishment of the HCC model and 8d treatment; NK cell depletion mice model; Human hepatoma model and NK cell transfer |