筛选SOD1靶向CBE
确定能有效降低SOD1表达的CBE和sgRNA组合。
设计五个sgRNA靶向SOD1外显子1中的CAA、CAG和CGA密码子，在HEK293T细胞中测试CBE活性，通过qRT-PCR、Western blot和深度测序检测编辑效率。
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通过体内碱基编辑治疗ALS小鼠模型
Treatment of a Mouse Model of ALS by In Vivo Base Editing
实验完整度
高包含体外HEK293T细胞中碱基编辑效率和特异性的验证、G93A-SOD1小鼠模型中的体内功能验证（生存期、运动功能、肌肉萎缩等），以及机制验证（SOD1包涵体减少、运动神经元保护）。
主要模型
HEK293T细胞 G93A-SOD1小鼠模型
重点核对
HEK293T细胞中CBE靶向SOD1的编辑效率（~19% C>T） G93A-SOD1小鼠鞘内注射剂量（8×10^10颗粒/载体） AAV9载体血清型 生存期分析（hSOD1 vs mRosa26） 疾病持续时间（从发病到终末期）
摘要
肌萎缩侧索硬化症（ALS）是一种使人衰弱且致命的疾病，可由超氧化物歧化酶1（SOD1）基因的突变引起。尽管ALS目前无法治愈，但CRISPR碱基编辑器有潜力通过产生无义突变来永久性地关闭突变SOD1基因的表达，从而治疗该疾病。然而，腺相关病毒（AAV）载体的有限承载能力限制了其治疗应用。在本研究中，我们建立了一个内含肽介导的反式剪接系统，能够体内递送由广泛使用的化脓性链球菌Cas9蛋白组成的胞嘧啶碱基编辑器（CBE）。我们证明，鞘内注射编码经工程改造以进行反式剪接并在突变SOD1基因中引入无义编码替换的分裂内含肽CBE的双AAV颗粒，延长了G93A-SOD1 ALS小鼠模型的生存期并显著减缓了疾病进展。与对照小鼠相比，经此分裂内含肽CRISPR碱基编辑器治疗的成年动物，其肌肉萎缩速率降低，肌肉去神经支配减少，神经肌肉功能改善，且终末期小鼠中SOD1免疫反应性包涵体减少高达40%。这项工作扩展了单碱基编辑器的能力，并展示了其在基因治疗中的潜力。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- 能否利用CRISPR碱基编辑器通过AAV体内递送，降低突变SOD1表达并治疗ALS小鼠模型？
- 核心机制
- 碱基编辑器通过C>T替换在SOD1基因中引入提前终止密码子，降低突变SOD1蛋白表达，从而减缓疾病进展。
- 主要证据
- 在G93A-SOD1小鼠中，鞘内注射编码分裂内含肽CBE的AAV9，使平均生存期增加约11%，疾病持续时间延长约39%，并减少SOD1包涵体、减缓肌肉萎缩和去神经支配。
- 研究意义
- 该研究证明碱基编辑器可用于治疗神经退行性疾病，并扩展了CRISPR碱基编辑器在基因治疗中的应用潜力。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
构建并验证分裂内含肽CBE
解决AAV包装限制，实现SpCas9-CBE的体内递送。
将SpCas9在Val957处拆分，融合R. marinus DnaB内含肽，通过双AAV载体分别编码N端和C端片段，在HEK293T细胞中验证蛋白反式剪接和编辑活性。
AAV9介导的体内递送与表达
评估双AAV载体在G93A-SOD1小鼠脊髓中的转导效率和细胞类型。
将AAV9-CBE-hSOD1或AAV9-CBE-mRosa26鞘内注射到56-60日龄G93A-SOD1小鼠，4周后通过免疫荧光和流式分析检测CBE表达，发现主要在星形胶质细胞中表达。
疗效评估
检测碱基编辑对ALS小鼠疾病进展的影响。
监测生存期、疾病持续时间、运动功能（转棒、握力）、体重变化。
机制分析
评估碱基编辑对SOD1蛋白、运动神经元和神经肌肉接头的影响。
对终末期脊髓切片进行免疫组化染色，量化SOD1包涵体面积、ChAT+运动神经元数量、去神经支配NMJ比例，并深度测序检测靶位点编辑频率。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 细胞培养 | DMEM培养基 | Corning | -- |
| 胎牛血清 | Life Technologies | -- | |
| 青霉素-链霉素 | Life Technologies | -- | |
| 细胞转染 | Lipofectamine 2000转染试剂 | Invitrogen | -- |
| RNA提取 | RNeasy mini试剂盒 | QIAGEN | -- |
| 逆转录 | 高容量cDNA逆转录试剂盒 | Applied Biosystems | -- |
| qPCR | iTaq Universal SYBR Green Supermix | Bio-Rad | -- |
| Western blot | NuPAGE LDS样品缓冲液 | Invitrogen | -- |
| Pierce BCA蛋白定量试剂盒 | Thermo Fisher Scientific | -- | |
| PVDF膜 | -- | -- | |
| 硝酸纤维素膜 | -- | -- | |
| 抗hSOD1抗体 | Cell Signaling Technology | 2770S | |
| 抗HA抗体 | Cell Signaling Technology | 3724 | |
| 抗V5抗体 | Cell Signaling Technology | 13202S | |
| 抗GAPDH抗体 | Cell Signaling Technology | 2118S | |
| 抗β-肌动蛋白抗体 | Cell Signaling Technology | 4970S | |
| 山羊抗兔HRP二抗 | Thermo Fisher Scientific | 65-6120 | |
| SuperSignal West Dura底物 | Thermo Fisher Scientific | -- | |
| Clarity Western ECL底物 | Bio-Rad | -- | |
| AAV生产 | pAAV9质粒 | -- | -- |
| pHelper质粒 | -- | -- | |
| 聚乙烯亚胺 | -- | -- | |
| Benzonase核酸酶 | Sigma-Aldrich | -- | |
| 碘克沙醇 | -- | -- | |
| Ultra-15离心过滤装置 | Amicon | -- | |
| 动物注射 | Hamilton注射器 | Hamilton | -- |
| 行为测试 | Rotamex-5转棒仪 | Columbus Instruments | -- |
| 握力计 | Harvard Apparatus | -- | |
| 免疫组化 | Leica CM3050 S冰冻切片机 | Leica | -- |
| VectaShield Hardset防淬灭封片剂 | Vector Laboratories | -- | |
| Leica TCS SP8共聚焦显微镜 | Leica | -- | |
| Zeiss Observer Z1显微镜 | Zeiss | -- | |
| 染色 | α-银环蛇毒素Alexa Fluor 647缀合物 | Thermo Fisher Scientific | B35450 |
| 深度测序 | Agencourt AMPure XP磁珠 | Beckman Coulter | -- |
| KAPA HyperPrep试剂盒 | Kapa Biosystems | -- | |
| Nextera XT DNA文库制备试剂盒 | Illumina | -- | |
| MiSeq v2试剂盒(500循环) | Illumina | -- | |
| bcl2fastq v2.17.1.14软件 | Illumina | -- | |
| 统计分析 | GraphPad Prism 8软件 | GraphPad | -- |
| 深度测序 | ImageJ软件 | -- | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 细胞实验 | HEK293T细胞转染量：1μg DNA/孔（24孔板） 阅读提示：Cell Culture and Transfection |
| 动物实验 | G93A-SOD1小鼠鞘内注射剂量：8×10^10 vector genomes/腺相关病毒 阅读提示：Injections |
| 行为测试 | 转棒转速从4到40 rpm，180秒加速 阅读提示：Behavior |
| 免疫组化 | 脊髓切片厚度：40μm 阅读提示：Immunohistochemistry |
| 深度测序 | 分析参数：Phred分数>26，比对到GRCh38或GRCm38 阅读提示：Deep Sequencing |