DNMT3B 3'UTR报告系统筛选SAM文库
鉴定能够调节DNMT3B mRNA稳定性的lncRNA
构建DNMT3B 3'UTR与嘌呤霉素抗性基因的报告载体，导入MCF-7细胞中，利用SAM系统激活内源lncRNA表达，通过嘌呤霉素筛选富集候选gRNA。
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通过HuR相互作用增强DNMT3表达的lncRNA RMST（已撤稿）
RETRACTED: lncRNA RMST Enhances DNMT3 Expression through Interaction with HuR
实验完整度
高包含CRISPR文库筛选、多细胞系敲除与回补、RNA稳定性实验、RNA pull-down和RIP等分子机制验证，及DNA甲基化功能实验。证据层级完整，功能与机制验证明确。
主要模型
MCF-7乳腺癌细胞系 MIA PaCa-2胰腺癌细胞系 HCT-116结肠癌细胞系
重点核对
RMST KO细胞系中DNMT3A和DNMT3B mRNA和蛋白水平的下降 RMST KO导致整体DNA甲基化降低约40% RMST与HuR和AUF1的相互作用，促进HuR与DNMT3B 3'UTR的结合 RMST增加DNMT3A和DNMT3B mRNA的稳定性（半衰期延长） DNMT3B 3'UTR报告系统筛选条件（嘌呤霉素浓度1.5 μg/mL，处理4天）
摘要
大量研究表明，基于CRISPR/Cas9的文库筛选是鉴定基因功能的非常强大的工具。然而，这些研究大多集中于蛋白质编码基因，而且很少有研究使用基因报告基因进行筛选。在本研究中，我们生成了DNA甲基转移酶3B（DNMT3B）报告基因，并针对一组聚焦的lncRNA筛选了CRISPR/Cas9协同激活介质（SAM）文库。通过这种筛选方法，我们鉴定了横纹肌肉瘤2相关转录本（RMST）作为DNMT3B的正调控因子。通过SAM激活内源性RMST或异位表达RMST证实了这一点。此外，RMST敲除（KO）抑制DNMT3，而在KO细胞中用RMST拯救可恢复DNMT3水平。最后，RMST KO抑制整体DNA甲基化，导致甲基化调控基因上调。机制上，RMST促进RNA结合蛋白HuR与DNMT3B 3'UTR之间的相互作用，增加DNMT3B的稳定性。总之，这些结果不仅为CRISPR文库筛选提供了报告系统的可行性，而且证明了先前未表征的因子RMST在调节DNA甲基化中的重要作用。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- lncRNA是否通过DNMT3的3'UTR调控其表达，从而影响整体DNA甲基化？
- 核心机制
- lncRNA RMST与RNA结合蛋白HuR相互作用，增强HuR与DNMT3B 3'UTR的结合，从而稳定DNMT3B mRNA，提高其表达。
- 主要证据
- 通过DNMT3B 3'UTR报告系统筛选SAM文库鉴定出RMST；通过细胞系中RMST KO和回补实验验证其对DNMT3表达的正调控；通过RNA pull-down、RIP和RNA稳定性实验证明RMST促进HuR结合并稳定mRNA。
- 研究意义
- 研究首次将3'UTR报告系统用于CRISPR文库筛选以鉴定lncRNA功能，揭示了RMST作为DNA甲基化调控因子的新角色，为癌症治疗提供潜在靶点。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
RMST对DNMT3表达的正向调控验证
验证RMST是否正向调控DNMT3A和DNMT3B的表达
在MCF-7、MIA PaCa-2和HCT-116细胞中利用CRISPR/Cas9敲除RMST，检测DNMT3A和DNMT3B的mRNA和蛋白水平，并在KO细胞中回补RMST观察恢复效果。
RMST对整体DNA甲基化的影响
探究RMST是否通过DNMT3调控影响整体DNA甲基化水平
提取RMST KO细胞的基因组DNA，使用甲基化定量试剂盒检测5-mC水平，并检测甲基化调控的肿瘤抑制基因表达。
机制研究：RMST与HuR相互作用稳定DNMT3 mRNA
阐明RMST增强DNMT3表达的分子机制
通过RNA沉淀和RIP实验检测RMST与HuR及AUF1的相互作用，以及RMST对HuR结合DNMT3B 3'UTR的影响；通过放线菌素D处理分析mRNA稳定性。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
文库筛选与报告系统
基因敲除和回补
DNA甲基化分析
RNA-蛋白质相互作用分析
RNA稳定性分析
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 载体构建 | pGL3-control载体 | Promega | -- |
| 抗体 | DNMT3A抗体 | Cell Signaling Technology | 2160 |
| DNMT3B抗体 | Cell Signaling Technology | 67259 | |
| DNMT1抗体 | Cell Signaling Technology | 5032 | |
| AUF1抗体 | Santa Cruz Biotechnology | sc-166577 | |
| HuR抗体 | Santa Cruz Biotechnology | sc-5261 | |
| GAPDH抗体 | Protein Tech | -- | |
| 细胞培养 | RPMI 1640培养基 | Sigma | -- |
| DMEM培养基 | Sigma | -- | |
| 胎牛血清 | -- | -- | |
| 马血清 | Gibco | -- | |
| L-谷氨酰胺 | Lonza | -- | |
| 质粒构建 | NEBuilder HiFi DNA组装试剂盒 | New England Biolabs | -- |
| Phusion聚合酶 | Thermo Fisher Scientific | -- | |
| 转染 | DNAfectin转染试剂 | Applied Biological Materials | -- |
| RNA提取 | Direct-zol RNA小提试剂盒 | Zymo Research | -- |
| cDNA合成 | RevertAid逆转录酶 | Thermo Fisher Scientific | -- |
| qRT-PCR | SYBR Green染料 | -- | -- |
| PCR引物 | PCR引物 | Integrated DNA Technologies | -- |
| DNA甲基化检测 | MethylFlash DNA甲基化定量试剂盒 | Epigentek | -- |
| 基因组DNA提取 | Quick-DNA微量提取试剂盒 | Zymo Research | -- |
| RNA pull-down | 生物素-16-UTP | PerkinElmer | -- |
| 链霉亲和素磁珠 | Pierce | -- | |
| RIP | Magna RIP RNA结合蛋白免疫沉淀试剂盒 | Millipore | -- |
| Western blot | PVDF膜 | -- | -- |
| Odyssey成像系统 | LI-COR Biosciences | -- | |
| UV交联 | Stratalinker紫外交联仪 | Stratagene | -- |
| 细胞系 | MCF-7细胞系 | ATCC | -- |
| MIA PaCa-2细胞系 | ATCC | -- | |
| HCT-116细胞系 | ATCC | -- | |
| 质粒构建 | pCDH-MSCV-copGFP-T2A-Pu载体 | System Biosciences | -- |
| pCR8载体 | Invitrogen | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 文库筛选 | MCF-7细胞中SAM组件的稳定表达；SAM文库gRNA设计（每个lncRNA 5个gRNA，总共421个lncRNA）；嘌呤霉素筛选浓度1.5 μg/mL，处理4天，再培养10天 阅读提示：Materials and Methods 中 'SAM Library' 和 'Library Screening' 部分，以及 Figure 1 的图注 |
| RMST敲除和回补 | CRISPR/Cas9 KO克隆的鉴定（通过基因组PCR和qRT-PCR确认）；回补实验中RMST表达载体的使用（感染后2天收获细胞） 阅读提示：Materials and Methods 中 'KO of RMST by the CRISPR/Cas9 Approach' 以及 Figure 2 和 Figure 3 的图注 |
| RNA稳定性检测 | 放线菌素D处理浓度2 μg/mL，时间点0、2、4、6、8小时；CHX处理浓度20 μg/mL（用于蛋白稳定性） 阅读提示：Materials and Methods 中 'RNA Stability Assay' 和 Figure 5 的图注 |
| RNA-蛋白质相互作用 | RNA pull-down使用生物素标记的RNA探针（RMST、DNMT3B 3'UTR和5'UTR），细胞裂解液孵育2小时，链霉亲和素磁珠沉淀；RIP使用HuR或AUF1抗体，UV交联条件为254 nm，150 mJ/cm2 阅读提示：Materials and Methods 中 'RNA Precipitation' 和 'UV Crosslinking RNA Immunoprecipitation'，以及 Figure 6 的图注 |
| DNA甲基化检测 | 采用MethylFlash DNA甲基化定量试剂盒检测整体DNA甲基化；每个实验至少重复三次，统计分析使用t检验或双因素方差分析 阅读提示：Materials and Methods 中 'Global DNA Methylation Analysis' 以及 Figure 4 的图注 |