构建hACE2转基因小鼠模型
建立表达人ACE2受体的动物模型，以研究SARS-CoV-2感染。
通过原核显微注射将人ACE2启动子和编码序列整合到小鼠基因组中，并通过PCR鉴定阳性后代。
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SARS-CoV-2感染导致小鼠睾丸严重病理变化
Infection of SARS-CoV-2 causes severe pathological changes in mouse testis
实验完整度
高包含体外细胞感染（假病毒和活病毒）、体内注射（生精小管和间质）以及组织学分析等多种证据层级，并进行了功能验证和机制探索。
主要模型
hACE2转基因小鼠 原代支持细胞 原代间质细胞
重点核对
hACE2转基因小鼠的构建及ACE2表达验证 SARS-CoV-2假病毒（rVSV）和活病毒感染模型 生精小管和睾丸间质注射的剂量和途径 病毒RNA检测和病理分析时间点（D3、D6、D18）
摘要
由严重急性呼吸综合征冠状病毒2型（SARS-CoV-2）引起的2019冠状病毒病（COVID-19）已影响全球超过6亿人。包括肺、肠和脑在内的多个器官可被SARS-CoV-2感染。已有报道称SARS-CoV-2受体血管紧张素转换酶2（ACE2）在人睾丸中表达。然而，睾丸是否也受SARS-CoV-2影响仍不清楚。在本研究中，我们构建了一个人ACE2（hACE2）转基因小鼠模型，其中hACE2基因的表达受hACE2启动子调控。来自hACE2转基因小鼠的支持细胞和间质细胞在体外可被SARS-CoV-2假病毒感染，并且将SARS-CoV-2假病毒注入生精小管后观察到严重的病理变化。进一步研究表明，来自hACE2转基因小鼠的支持细胞和间质细胞也可被真实的SARS-CoV-2病毒感染。在睾丸间质注射后，真实的SARS-CoV-2病毒首先扩散至间质细胞，随后在生精小管内被检测到，进而导致生殖细胞丢失和生精小管破坏。我们的研究表明，睾丸很可能是SARS-CoV-2病毒的靶器官。应关注SARS-CoV-2患者的生殖功能。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- SARS-CoV-2感染是否影响睾丸，其病理变化如何。
- 核心机制
- SARS-CoV-2通过hACE2受体感染睾丸支持细胞和间质细胞，病毒从间质扩散至生精小管，突破血睾屏障，导致生殖细胞丢失和生精小管破坏。
- 主要证据
- 体外感染实验显示支持细胞和间质细胞对假病毒和活病毒敏感；体内注射实验显示病毒从间质扩散至生精小管，引起生精小管破坏和生殖细胞丢失。
- 研究意义
- 证明睾丸是SARS-CoV-2的潜在靶器官，提示应关注患者的生殖功能，并提供了研究病毒影响生殖系统的动物模型。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
检测hACE2在小鼠各组织的表达
验证hACE2转基因小鼠中hACE2蛋白的表达模式。
收集多种器官（心、肠、肝、肺、脾、脑、睾丸），通过Western blot和免疫组化检测hACE2蛋白的表达。
假病毒感染实验
评估hACE2转基因小鼠睾丸对SARS-CoV-2假病毒的易感性。
将rVSV-luciferase-SARS-CoV-2或rVSV-eGFP-SARS-CoV-2注入小鼠生精小管，通过活体成像和免疫组化分析病毒复制和病理变化。
活病毒感染实验（鼻内）
评估经鼻内途径感染后病毒在小鼠肺和睾丸中的分布和病理变化。
hACE2小鼠经鼻内接种活SARS-CoV-2，在感染后3、6、9天通过RT-qPCR和免疫组化检测病毒RNA和蛋白，以及组织病理学检查。
活病毒感染实验（睾丸间质注射）
评估直接将活病毒注射到睾丸间质后病毒的传播和病理变化。
将SARS-CoV-2注入睾丸间质，在感染后3天和6天通过免疫组化检测病毒蛋白和生殖细胞标志物，分析病毒传播和组织损伤。
体外细胞感染实验
验证支持细胞和间质细胞是否可被SARS-CoV-2感染。
分离培养原代支持细胞和间质细胞，感染假病毒或活病毒，通过荧光显微镜或免疫荧光检测病毒感染情况。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 病毒检测 | RNeasy 小量提取试剂盒 | QIAGEN | -- |
| 一步法PrimeScript RT-PCR试剂盒 | TaKaRa | -- | |
| 细胞培养 | IV型胶原酶 | VETEC | V900893 |
| 脱氧核糖核酸酶I | AppliChem | A37780500 | |
| 透明质酸酶 | SIGMA | SIAL-H3506 | |
| Percoll | GE | -- | |
| 抗体 | 抗MVH抗体 | Abcam | ab13840 |
| 抗SOX9抗体 | Millipore | AB5535 | |
| 抗SOX9抗体 | Sigma | AMAB90795 | |
| 抗核蛋白抗体 | Sino Biological | 40143-R001 | |
| 抗CD3抗体 | Abcam | ab11089 | |
| 抗3β-HSD抗体 | Santa Cruz | sc-30820 | |
| FITC标记的驴抗兔IgG | Jackson ImmunoResearch | 711-095-152 | |
| TRITC标记的驴抗小鼠IgG | Jackson ImmunoResearch | 715-025-151 | |
| TRITC标记的驴抗山羊IgG | Jackson ImmunoResearch | 705-025-147 | |
| Western blot | ACE2抗体 | Abcam | ab108209 |
| GAPDH抗体 | Boao | ab1039t | |
| 设备 | IVIS Spectrum 小动物活体成像系统 | PerkinElmer | 5717 |
| Bead Ruptor Elite 组织匀浆机 | Omni International | -- | |
| ABI QuantStudio 7 实时荧光定量PCR仪 | Applied Biosystems | -- | |
| ODYSSEY Sa 红外成像系统 | LI-COR Biosciences | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| hACE2转基因小鼠的构建与验证 | hACE2启动子和编码序列的克隆方法、显微注射的受体小鼠品系（C57BL/6）、基因分型引物序列。 阅读提示：Materials and Methods: Mice |
| 假病毒感染（生精小管注射） | 病毒滴度（5×10^6 FFU/mL）、注射体积（10 μL）、注射途径（经 rete testis）、时间点（24小时、3天、18天）。 阅读提示：Materials and Methods: Pseudoviruses construction and infection |
| 活病毒感染（鼻内） | 病毒株（hCoV-19/China/CAS-B001/2020）、剂量（5×10^5 TCID50/50 μL）、小鼠周龄（8周龄）、时间点（3、6、9天）。 阅读提示：Materials and Methods: Authentic SARS-CoV-2 infection |
| 活病毒感染（睾丸间质注射） | 病毒剂量（10^5 TCID50/mL，10 μL）、注射途径（testis interstitium）、时间点（3天、6天）。 阅读提示：Materials and Methods: Authentic SARS-CoV-2 infection |
| 支持细胞和间质细胞的分离培养 | 小鼠周龄（4周龄）、消化酶浓度和孵育时间、Percoll梯度离心条件、培养条件（DMEM/F12+10% FBS）。 阅读提示：Materials and Methods: Isolation and culture of sertoli cell; Isolation and culture of leydig cell |
| 体外病毒感染 | 感染复数（MOI=1）、孵育时间（24小时）、固定条件（4%多聚甲醛）。 阅读提示：Materials and Methods: Authentic SARS-CoV-2 infection |